Name: the use of sc1 (pluripotin) to support mesc self-renewal in the absence of lif
Uploaded: 2009-11-18T17:30:00
Duration: 5 min 58 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about The use of SC1 Pluripotin to Support mESC Self-renewal in the Absence of LIF at JoVE.com

Författarna vill tacka Dr Sheng Ding av The Scripps Research Institute och Dr Hongkui Deng av Pekings universitet för deras hjälp och vägledning.

1. Beredning av MEF matare plattor <ol><li> En dag innan cellerna odling ES, tina en flaska av bestrålat E14.5 CF-1 MEF feeder celler (se vårt förfarande om hur man tina ES-celler). </li><li> Tavla MEF mataren celler med en täthet på 10.000 celler / brunn i en 12 brunnar. Inkubera cellerna över natten vid 37 ° C och 5% CO 2. MEF celler media: DMEM kompletteras med 10% ES-PBS, 1X glutamin och 1X icke-essentiella aminosyror. </li></ol> 2. Underhåll av självförnyelse av Mouse ES-celler <ol><li> Lossa ES-celler med hjälp av trypsin. Seed på celler med en täthet på 50.000 celler / brunn på den tidigare beredda plattorna MEF matare i tillväxt media (Knockout MEM kompletteras med 15% KSR, 4 mm L-glutamin, 0,1 mM icke-essentiella aminosyror och 1X BME) kompletteras med SC1 på önskad koncentration (vi använde 100 nm, 300 nm och 1 M). Vi lade också till en positiv kontroll brunn som kompletterades med 1000 μ / ml i LIF. Inkubera cellerna över natten vid 37 ° C och 5% CO 2. </li><li> Kultur cellerna vid 37 ° C och 5% CO 2 i 3-4 dagar i varje passage. Uppdatera media varje 48 timmar. </li><li> Passage celler från 1:10 till 1:15 med trypsin att upprätthålla en liknande täthet som den ursprungliga sådd densitet. Efter 5 passager, kan cellerna undersökas för uttrycket av typiska pluripotens markörer med hjälp av immuncytokemi. </li></ol> 3. Immuncytokemiska Undersökning av pluripotens Markörer <ol><li> Tvätta cellerna försiktigt tre gånger med PBS. </li><li> Fixera cellerna med 500 ìl fixativ i 20 minuter i rumstemperatur. </li><li> Tvätta cellerna försiktigt tre gånger med PBS. </li><li> Blockera icke-specifik bindning med 500 l blockerande buffert i en timme vid rumstemperatur. </li><li> Inkubera cellerna med 250 l av de specifika primära antikroppen (vi använde NANOG, Sox2, SSEA1 och Oct4 på följande spädningar: 1:500, 1:2000, 1:500 och 1:500) </li><li> Tvätta cellerna försiktigt tre gånger med PBS. </li><li> Inkubera cellerna med 250 l av sekundära antikroppar i två timmar i rumstemperatur, hålla borta från ljus (vi använde åsna anti-mus-konjugerat med Alexa Fluor ® 555 på 1:2000 och åsna anti-kanin konjugerat med Alexa Fluor ® 488 vid 1 : 2000). </li><li> Tvätta cellerna försiktigt tre gånger med PBS. </li><li> Lägg DAPI (slutlig koncentration 1 mikrogram / ml) till den sista tvättningen och inkubera 5 minuter att visualisera kärnor. </li><li> Analysera cellerna under ett fluorescerande mikroskop. </li></ol> 4. Representativa resultat: 1. Morfologi resultat: Mus ES-celler (ESC R1) odlades på MEF matare celler i närvaro av antingen LIF eller SC1 att upprätthålla självförnyelse på en odifferentierad stat. Efter den andra passagen kunde differentiering observeras i celler utan LIF eller SC1 (negativ kontroll) och efter 5 passager princip ingen odifferentierade kolonier observerades. LIF (positiv kontroll) behandlade bisamhällena kvar i en odifferentierad staten under 5 cellen passager. Celler som behandlats med SC1 vid koncentrationer på 300 Nm eller 100 nM också varit odifferentierade efter 5 stycken, men de celler som behandlats med 1 mikroM SC1 erfarna celldöd efter den fjärde passagen. (Fig 2 med ca not) I tabell 1 sammanfattas morfologiska observationer. 2. Redovisning av pluripotens Markörer Mus ES-celler bibehållas under 5 passager fastställdes och granskas av immuncytokemi för SSEA1, Oct4, NANOG och Sox2. Marker uttryck liknade cellerna upprätthålls i LIF. (Fig 3 och 4 i app anmärkning) <img src="/files/ftp_upload/1550/1550fig2a.jpg" alt="Figur 1" /> Figur 1: morfologi jämförelse av celler kvar i LIF eller SC1. Ingen skillnad i morfologi observerades. <img src="/files/ftp_upload/1550/1550fig2c.jpg" alt="Figur 2 och 3" /> Figur 2 och Figur 3: NANOG, SSEA1, Sox2 och Oct4 färgning av ES-celler upprätthålls med SC1 eller LIF (fig 4 av app anmärkning). Celler hållas i SC1 visar liknande pluripotens markör uttryck för att cellerna upprätthålls i LIF. Tabell 1 <table border="1" cellspacing="0" cellpadding="0"><tbody><tr><td></td><td> Negativ kontroll </td><td> LIF positiv kontroll </td><td> SC1 1um </td><td> SC1 300 nm </td><td> SC1 100 nM </td></tr><tr><td> 1:a Passage </td><td> Normal ES cellmorfologin </td><td> Normal ES cellmorfologin </td><td> Normal ES cellmorfologin </td><td> Normal ES cellmorfologin </td><td> Normal ES cellmorfologin </td></tr><tr><td> 2:a Passage </td><td> Vissa differentierade morfologi </td><td> Normal ES cellmorfologin </td><td> Normal ES cellmorfologin </td><td> Normal ES cellmorfologin </td><td> Normal ES cellmorfologin </td></tr><tr><td> 3:e Passage </td><td> Majoritet av differentierade celler </td><td> Normal ES cellmorfologin </td><td> Normal ES cellmorfologin </td><td> Normal ES cellmorfologin </td><td> Normal ES cellmorfologin </td></tr><tr><td> 4:e Passage </td><td> Inga ESC kolonier </td><td> Normal ES cellmorfologin </td><td> Celldöd som observerats </td><td> Normal ES cellmorfologin </td><td> Normal ES cellmorfologin </td></tr><tr><td> 5:e Passage </td><td> differentierade </td><td> Normal ES cellmorfologin </td><td> Celldöd som observerats </td><td> Normal ES cellmorfologin </td><td> Normal ES cellmorfologin </td></tr></tbody></table>

<ol>
	<li>Williams, R. L., Hilton, D. J., Pease, S., Willson, T. A., Stewart, C. L., Gearing, D. P., Wagner, E. F., Metcalf, D., Nicola, N. A., Gough, N. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myeloid+leukaemia+inhibitory+factor+maintains+the+developmental+potential+of+embryonic+stem+cells.">Myeloid leukaemia inhibitory factor maintains the developmental potential of embryonic stem cells.</a> Nature. 336, 684-687 (1988).</li><li>Ying, Q. L., Wray, J., Nichols, J., Batlle-Morera, L., Doble, B., Woodgett, J., Cohen, P., Smith, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+ground+state+of+embryonic+stem+cell+self-renewal.">The ground state of embryonic stem cell self-renewal.</a> Nature. 453, 519-523 (2008).</li><li>Chen, S., Do, J. T., Zhang, Q., Yao, S., Yan, F., Peters, E. C., Scholer, H. R., Schultz, P. G., Ding, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Self-renewal+of+embryonic+stem+cells+by+a+small+molecule.">Self-renewal of embryonic stem cells by a small molecule.</a> Proc. Natl. Acat. Sci. USA. 103, 17266-17271 (2006).</li></ol>

Författarna av denna artikel är anställda av Stemgent som producerar reagens och instrument som används i denna artikel.

Den lilla molekylen SC1 kan användas för att upprätthålla självförnyelse med en odifferentierad stat i mus ES-celler. Innan du använder på ett oprövat cellinje, bör det dock vara titreras för att bestämma den optimala koncentrationen. Till exempel, testade vi tre koncentrationer på musen ES cellinje ESC R1. 100 nm och 300 koncentrationer nM kunde upprätthålla celler mus ES, var dock en 1 mikroM koncentration giftiga. SC1 kan även användas under feeder-fri förhållanden.

<!DOCTYPE html PUBLIC "-//W3C//DTD XHTML 1.0 Transitional//EN" "http://www.w3.org/TR/xhtml1/DTD/xhtml1-transitional.dtd">
<html xmlns="http://www.w3.org/1999/xhtml" xml:lang="en" lang="en">	
		
		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>SC1</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Stemgent</td>
<td>04-0011</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>LIF</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Millipore</td>
<td>ESG1107</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>SSEA-1 antibody</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Santa Cruz</td>
<td>21702</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Nanog antibody</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Abcam</td>
<td>ab21603</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Sox2 antibody</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Chemicon</td>
<td>Ab5603</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Oct4 antibody</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Santa Cruz</td>
<td>SC-5279</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

the use of sc1 (pluripotin) to support mesc self-renewal in the absence of lif

Mus embryonala stamceller (ES-celler) är konventionellt odlade med leukemi hämmande faktor (LIF) för att upprätthålla självförnyelse.<sup&gt; 1</sup&gt; Men LIF dyrt och aktivering av LIF/JAK/STAT3 vägen är inte absolut krävs för att upprätthålla självförnyelse stat.<sup&gt; 2</sup&gt; Den SC1 liten molekyl kan vara ett ekonomiskt alternativ till LIF. SC1 fungerar genom dubbla hämning av Ras-GAP och ERK1.<sup&gt; 3</sup&gt; Illustration av sin verkningsmekanism gör det till ett användbart verktyg för att studera de grundläggande molekylära mekanismen för självförnyelse. Här kan vi visa förfarandet för ES odling musceller i närvaro av SC1 och visa att de kan upprätthålla självförnyelse i avsaknad av LIF. Celler odlade med SC1 visade liknande morfologi jämfört med celler upprätthålls med LIF. Båda uppvisade typisk morfologi musen ES efter fem passager. Redovisning av typiska pluripotens markörer (Oct4, Sox2, NANOG och SSEA1) observerades efter fem passager i närvaro av SC1. Dessutom orsakade SC1 ingen uppenbar toxicitet på mus ES-celler.

Watch this Scientific Journal Video about The use of SC1 Pluripotin to Support mESC Self-renewal in the Absence of LIF at JoVE.com

The use of SC1 Pluripotin to Support mESC Self-renewal in the Absence of LIF

SC1 fungerar genom dubbla hämning av Ras-GAP och ERK1. Vi testade funktionen av SC1 att stödja cell mus ES självförnyelse i avsaknad av LIF och visade att SC1 kan bibehålla självförnyelse av cell musen ES kulturer.

Användningen av SC1 (Pluripotin) för att stödja Mesc självförnyelse i frånvaro av LIF

Mouse embryonic stem (ES) cells are conventionally cultured with Leukemia Inhibitory Factor (LIF) to maintain self-renewal.1 However, LIF is expensive and ...

Research

JoVE Journal

Biology

The use of SC1 (Pluripotin) to Support mESC Self-renewal in the Absence of LIF

Use of the Protease Fluorescent Detection Kit to Determine Protease Activity

Användning av Protease Fluorescent Detection Kit Avgöra Protease aktivitet

The Protease Fluorescent Detection Kit provides ready-to-use reagents for detecting the presence of protease activity. This simple assay to detect ...

The use of Biofeedback in Clinical Virtual Reality: The INTREPID Project

Användningen av Biofeedback i klinisk Virtual Reality: Intrepid Project

Generalized anxiety disorder (GAD) is a psychiatric disorder characterized by a constant and unspecific anxiety that interferes with daily-life ...

Quantification of &gamma;H2AX Foci in Response to Ionising Radiation

Quantification of ÃƒÅ½Ã‚Â³H2AX Foci in Response to Ionising Radiation

Kvantifiering av γH2AX Foci som svar på joniserande strålning

DNA double-strand breaks (DSBs), which are induced by either endogenous metabolic processes or by exogenous sources, are one of the most critical DNA ...

Oct4GiP Reporter Assay to Study Genes that Regulate Mouse Embryonic Stem Cell Maintenance and Self-renewal

Oct4GiP Reporter analys för att studera gener som reglerar Mouse embryonala Underhåll Stem Cell och självförnyelse

Pluripotency and self-renewal are two defining characteristics of embryonic stem cells (ES cells). Understanding the underlying molecular mechanism will ...

The Use of Chemostats in Microbial Systems Biology

Användning av kemostater i Microbial Systembiologi

Cells regulate their rate of growth in response to signals from the external world. As the cell grows, diverse cellular processes must be coordinated ...

Using Caenorhabditis elegans as a Model System to Study Protein Homeostasis in a Multicellular Organism

Using Caenorhabditis elegans as a Model System to Study Protein Homeostasis in a Multicellular Organism

The folding and assembly of proteins is essential for protein function, the long-term health of the cell, and longevity of the organism. Historically, the ...

Identification of Key Factors Regulating Self-renewal and Differentiation in EML Hematopoietic Precursor Cells by RNA-sequencing Analysis

Identifiering av nyckelfaktorer Reglersjälvförnyelse och differentiering i EML Hematopoietisk prekursorceller genom RNA-sekvensering analys

Hematopoietic stem cells (HSCs) are used clinically for transplantation treatment to rebuild a patient&#39;s hematopoietic system in many diseases such as ...

Use of Enzymatic Biosensors to Quantify Endogenous ATP or H2O2 in the Kidney

Use of Enzymatic Biosensors to Quantify Endogenous ATP or H2O2 in the Kidney

Användning av enzymatisk Biosensors att kvantifiera Endogenous ATP eller H<sub&gt; 2</sub&gt; O<sub&gt; 2</sub&gt; I Kidney

Enzymatic microelectrode biosensors have been widely used to measure extracellular signaling in real-time. Most of their use has been limited to brain ...

Development of an Insert Co-culture System of Two Cellular Types in the Absence of Cell-Cell Contact

Utveckling av en in Co-kultur system av två Cellular typer i frånvaro av cell-cellkontakt

The role of secreted soluble factors in the modification of cellular responses is a recurrent theme in the study of all tissues and systems. In an attempt ...

The Use of Ex Vivo Whole-organ Imaging and Quantitative Tissue Histology to Determine the Bio-distribution of Fluorescently Labeled Molecules

The Use of Ex Vivo Whole-organ Imaging and Quantitative Tissue Histology to Determine the Bio-distribution of Fluorescently Labeled Molecules

Användningen av<em&gt; Ex vivo</em&gt; Hela organ Imaging och Kvantitativ Tissue histologi att bestämma Bio-fördelningen av fluorescerande molekyler

Fluorescent labeling is a well-established process for examining the fate of labeled molecules under a variety of experimental conditions both in vitro ...