Name: the use of sc1 (pluripotin) to support mesc self-renewal in the absence of lif
Uploaded: 2009-11-18T17:30:00
Duration: 5 min 58 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about The use of SC1 Pluripotin to Support mESC Self-renewal in the Absence of LIF at JoVE.com

Scripps Araştırma Enstitüsü&#39;nden Dr. Sheng Ding ve Pekin Üniversitesi Dr. HongKui Deng yazarlar, onların yardım ve yön için teşekkür etmek istiyorum.

1. MEF besleyici tabak hazırlanması <ol><li> Kültür ES hücrelerinin bir gün önce, bir çözülme bir flakon ışınlanmış E14.5 CF-1 MEF besleyici hücreler (ES hücrelerinin nasıl Çözülme yordama bakın). </li><li> 10.000 hücrelerinin yoğunluğu Plaka MEF besleyici hücreler / 12 plaka. 37 ° C ve% 5 CO 2 geceleme hücreleri inkübe edin. MEF hücre medya: DMEM% 10 ES-PBS, 1X glutamin ve 1X non-esansiyel amino asitleri ile desteklenmiştir. </li></ol> 2. Kendinden Fare ES Hücre Yenileyici Bakım <ol><li> Tripsin kullanarak ES hücreleri ayırın. / Iyi büyüme ortamı önceden hazırlanmış MEF besleyici plakaları (Nakavt MEM,% 15 KSR, 4 mM L-glutamin, 0.1 mM non-esansiyel amino asitler ve 1X BME ile desteklenmiş) 50.000 hücrelerinin yoğunluğu Tohum hücreleri SC1 ile desteklenmiş istenilen konsantrasyonda (100 nM 300 nM ve 1 mcM). Ayrıca 1000 μ / ml LIF ile desteklenmiş iyi bir pozitif kontrol ekledi. 37 ° C ve% 5 CO 2 geceleme hücreleri inkübe edin. </li><li> Kültür 37 hücreleri ° C ve% 5 CO 2 3-4 gün için her pasajda. Yenile medya her 48 saatte. </li><li> Passage hücreleri ilk tohumlama yoğunluğu gibi benzer bir yoğunluğunu korumak için tripsin ile 1:10 - 1:15. 5 pasajlar sonra, hücreler tipik pluripotency belirteçlerin immünsitokimya kullanarak ifade için incelenebilir. </li></ol> 3. Pluripotency Belirteçleri İmmünositokimyasal Sınav <ol><li> Hücreler PBS ile hafifçe üç kez yıkayın. </li><li> 500 oda sıcaklığında 20 dakika fiksatif ul hücreleri sabitleyin. </li><li> Hücreler PBS ile hafifçe üç kez yıkayın. </li><li> Oda sıcaklığında bir saat için 500 ul engelleme tampon ile non-spesifik bağlama engelleyin. </li><li> 250 ul spesifik primer antikor (1:500, 1:2000, 1:500, 1:500 aşağıdaki dilüsyonları Nanog, Sox2, SSEA1 ve Oct4) hücreleri inkübe </li><li> Hücreler PBS ile hafifçe üç kez yıkayın. </li><li> (1 1:2000 ve eşek Alexa Fluor ® 488 anti-tavşan konjuge anti-fare Alexa Fluor konjuge ® 555 eşek kullanılan ışıktan uzak tutarak, ikincil antikor 250 ul hücreleri iki saat oda sıcaklığında inkübe edin. : 2000). </li><li> Hücreler PBS ile hafifçe üç kez yıkayın. </li><li> Son yıkama DAPI (son konsantrasyonu 1 mcg / ml) ve çekirdekleri görselleştirmek için 5 dakika inkübe edin. </li><li> Floresan mikroskop altında hücrelerin analiz edin. </li></ol> 4. Temsilcisi Sonuçlar: 1. Morfoloji sonuçları: Fare ES hücrelerinin (ESC R1), farklılaşmamış bir halde kendini yenileme sürdürmek için ya LIF veya SC1 varlığı MEF besleyici hücreler yetişen. Ikinci geçit sonra LIF veya SC1 (negatif kontrol) olmadan, farklılaşma hücrelerinde gözlenen olabilir ve 5 pasajlar sonra aslında hiç farklılaşmamış koloniler gözlenmiştir. LIF (pozitif kontrol) tedavi koloniler 5 hücre pasajlar boyunca farklılaşmamış bir devlet kaldı. 300 nm veya 100 nM konsantrasyonlarda SC1 ile tedavi Hücreler aynı zamanda 5 pasajlar sonra farklılaşmamış kaldı, ancak, hücrelerin dördüncü geçtikten sonra 1 mcM SC1 deneyimli hücre ölümü ile tedavi. (App not şekil 2) Tablo 1 gözlemler özetlenmiştir. 2. Pluripotency Markers İfadesi 5 pasajlar sürdürülen Fare ES hücrelerinin SSEA1, Oct4, Nanog ve Sox2 için sabit ve immünsitokimya tarafından incelendi. Marker ifade LIF muhafaza hücreleri için benzer. (App not şekil 3 ve 4) <img src="/files/ftp_upload/1550/1550fig2a.jpg" alt="Şekil 1" /> Şekil 1: LIF veya SC1 muhafaza hücreleri Morfoloji karşılaştırılması. Morfoloji açısından fark yok gözlendi. <img src="/files/ftp_upload/1550/1550fig2c.jpg" alt="Şekil 2 ve 3" /> Şekil 2 ve Şekil 3: Nanog, SSEA1, Sox2 ve bakımı, SC1 veya LIF (app not şekil 4) ile ES hücrelerinin Oct4 boyama . SC1 olarak tutulan hücreler LIF muhafaza hücreleri için benzer pluripotency işaretleyici ifade göstermektedir. Tablo 1 <table border="1" cellspacing="0" cellpadding="0"><tbody><tr><td></td><td> Negatif Kontrol </td><td> LIF Pozitif Kontrolü </td><td> SC1 1uM </td><td> SC1 300 Nm </td><td> SC1 100 Nm </td></tr><tr><td> 1. Passage </td><td> Normal ES hücre morfolojisi </td><td> Normal ES hücre morfolojisi </td><td> Normal ES hücre morfolojisi </td><td> Normal ES hücre morfolojisi </td><td> Normal ES hücre morfolojisi </td></tr><tr><td> 2. Passage </td><td> Bazı farklılaştırılmış morfolojisi </td><td> Normal DS hücre morfolojisi </td><td> Normal ES hücre morfolojisi </td><td> Normal ES hücre morfolojisi </td><td> Normal ES hücre morfolojisi </td></tr><tr><td> 3. Passage </td><td> Farklılaşmış hücrelerin büyük bir çoğunluğu </td><td> Normal ES hücre morfolojisi </td><td> Normal ES hücre morfolojisi </td><td> Normal ES hücre morfolojisi </td><td> Normal ES hücre morfolojisi </td></tr><tr><td> 4. Passage </td><td> Yok ESC koloniler </td><td> Normal ES hücre morfolojisi </td><td> Hücre ölümü gözlenen </td><td> Normal ES hücre morfolojisi </td><td> Normal ES hücre morfolojisi </td></tr><tr><td> 5. Passage </td><td> farklılaştırılmış </td><td> Normal ES hücre morfolojisi </td><td> Hücre ölümü gözlenen </td><td> Normal ES hücre morfolojisi </td><td> Normal ES hücre morfolojisi </td></tr></tbody></table>

<ol>
	<li>Williams, R. L., Hilton, D. J., Pease, S., Willson, T. A., Stewart, C. L., Gearing, D. P., Wagner, E. F., Metcalf, D., Nicola, N. A., Gough, N. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myeloid+leukaemia+inhibitory+factor+maintains+the+developmental+potential+of+embryonic+stem+cells.">Myeloid leukaemia inhibitory factor maintains the developmental potential of embryonic stem cells.</a> Nature. 336, 684-687 (1988).</li><li>Ying, Q. L., Wray, J., Nichols, J., Batlle-Morera, L., Doble, B., Woodgett, J., Cohen, P., Smith, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+ground+state+of+embryonic+stem+cell+self-renewal.">The ground state of embryonic stem cell self-renewal.</a> Nature. 453, 519-523 (2008).</li><li>Chen, S., Do, J. T., Zhang, Q., Yao, S., Yan, F., Peters, E. C., Scholer, H. R., Schultz, P. G., Ding, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Self-renewal+of+embryonic+stem+cells+by+a+small+molecule.">Self-renewal of embryonic stem cells by a small molecule.</a> Proc. Natl. Acat. Sci. USA. 103, 17266-17271 (2006).</li></ol>

Bu makalenin yazarları, bu yazıda kullanılan reaktifler ve aletleri üreten Stemgent tarafından istihdam edilmektedir.

Küçük molekül SC1 fare ES hücreleri farklılaşmamış bir devlet ile kendini yenileme korumak için kullanılabilir. Ancak, denenmemiş bir hücre hattı kullanmadan önce, optimal konsantrasyonunu belirlemek için titre edilmelidir. Örneğin, fare ES hücre hattı ESC R1 üç konsantrasyonları test etti. 100 nM ve 300 nM konsantrasyonlarda fare ES hücrelerinin sürdürmek başardık, ancak 1 mcM konsantrasyonu toksik oldu. SC1 aynı zamanda besleyici-koşullar altında kullanılabilir.

<!DOCTYPE html PUBLIC "-//W3C//DTD XHTML 1.0 Transitional//EN" "http://www.w3.org/TR/xhtml1/DTD/xhtml1-transitional.dtd">
<html xmlns="http://www.w3.org/1999/xhtml" xml:lang="en" lang="en">	
		
		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>SC1</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Stemgent</td>
<td>04-0011</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>LIF</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Millipore</td>
<td>ESG1107</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>SSEA-1 antibody</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Santa Cruz</td>
<td>21702</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Nanog antibody</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Abcam</td>
<td>ab21603</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Sox2 antibody</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Chemicon</td>
<td>Ab5603</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Oct4 antibody</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Santa Cruz</td>
<td>SC-5279</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

the use of sc1 (pluripotin) to support mesc self-renewal in the absence of lif

Fare embriyonik kök (ES) hücreleri, geleneksel olarak kendini yenileme korumak için lösemi inhibitör faktörü (LIF) ile kültüre.<sup&gt; 1</sup&gt; Ancak, LIF pahalı ve LIF/JAK/STAT3 yolun aktivasyonu kesinlikle kendini yenileme durumunu korumak için gerekli değildir.<sup&gt; 2</sup&gt; SC1 küçük molekül LIF için ekonomik bir alternatif olabilir. Ras-GAP ve ERK1 çift inhibisyonu yoluyla SC1 fonksiyonları.<sup&gt; 3</sup&gt; İllüstrasyon eylem mekanizması kendini yenileme temel moleküler mekanizmayı incelemek için yararlı bir araçtır. Burada SC1 varlığını göstermek ve kültür fare ES hücrelerinin için prosedür LIF yokluğunda kendini yenileme korumak mümkün olduğunu göstermektedir. SC1 ile kültüre hücreler LIF ile devam hücrelerine benzer morfoloji gösterdi. Her ikisi de beş pasajlar sonra normal fare ES morfolojisi sergiledi. Tipik pluripotency belirteçlerin İfade (Oct4, Sox2, Nanog, ve SSEA1) SC1 varlığı beş pasajlar sonra gözlendi. Ayrıca, SC1 fare ES hücreleri üzerinde hiçbir belirgin toksisite neden oldu.

Watch this Scientific Journal Video about The use of SC1 Pluripotin to Support mESC Self-renewal in the Absence of LIF at JoVE.com

The use of SC1 Pluripotin to Support mESC Self-renewal in the Absence of LIF

Ras-GAP ve ERK1 çift inhibisyonu yoluyla SC1 fonksiyonları. Biz LIF yokluğunda fare ES hücre kendini yenileme destekleyen SC1 fonksiyonu test edilmiş ve SC1 fare ES hücre kültürleri kendini yenileme korumak mümkün olduğunu göstermiştir.

Kendini yenileme LIF Yokluğunda Mesc Destek SC1 (Pluripotin) kullanımı

Mouse embryonic stem (ES) cells are conventionally cultured with Leukemia Inhibitory Factor (LIF) to maintain self-renewal.1 However, LIF is expensive and ...

Research

JoVE Journal

Biology

The use of SC1 (Pluripotin) to Support mESC Self-renewal in the Absence of LIF

Use of the Protease Fluorescent Detection Kit to Determine Protease Activity

Proteaz Aktivitesi belirleme Proteaz Floresan Algılama Kit kullanın

The Protease Fluorescent Detection Kit provides ready-to-use reagents for detecting the presence of protease activity. This simple assay to detect ...

The use of Biofeedback in Clinical Virtual Reality: The INTREPID Project

Klinik Sanal Gerçeklik Biofeedback kullanımı: INTREPID Projesi

Generalized anxiety disorder (GAD) is a psychiatric disorder characterized by a constant and unspecific anxiety that interferes with daily-life ...

Quantification of &gamma;H2AX Foci in Response to Ionising Radiation

Quantification of ÃƒÅ½Ã‚Â³H2AX Foci in Response to Ionising Radiation

İyonlaştırıcı Radyasyon Cevabı γH2AX Foci Kantitasyonu

DNA double-strand breaks (DSBs), which are induced by either endogenous metabolic processes or by exogenous sources, are one of the most critical DNA ...

Oct4GiP Reporter Assay to Study Genes that Regulate Mouse Embryonic Stem Cell Maintenance and Self-renewal

Fare Embriyonik Kök Hücre Bakım ve Kendini yenileme Regulate Genler Okumak Oct4GiP Reporter Assay

Pluripotency and self-renewal are two defining characteristics of embryonic stem cells (ES cells). Understanding the underlying molecular mechanism will ...

The Use of Chemostats in Microbial Systems Biology

Mikrobiyal Systems Biyoloji Chemostats Kullanımı

Cells regulate their rate of growth in response to signals from the external world. As the cell grows, diverse cellular processes must be coordinated ...

Using Caenorhabditis elegans as a Model System to Study Protein Homeostasis in a Multicellular Organism

Using Caenorhabditis elegans as a Model System to Study Protein Homeostasis in a Multicellular Organism

The folding and assembly of proteins is essential for protein function, the long-term health of the cell, and longevity of the organism. Historically, the ...

Identification of Key Factors Regulating Self-renewal and Differentiation in EML Hematopoietic Precursor Cells by RNA-sequencing Analysis

RNA dizileme Analizi ile EML Hematopoetik Öncü Hücreler Self-yenileme ve farklılaşma Düzenlenmesi Anahtar Faktörler belirlenmesi

Hematopoietic stem cells (HSCs) are used clinically for transplantation treatment to rebuild a patient&#39;s hematopoietic system in many diseases such as ...

Use of Enzymatic Biosensors to Quantify Endogenous ATP or H2O2 in the Kidney

Use of Enzymatic Biosensors to Quantify Endogenous ATP or H2O2 in the Kidney

Enzimatik Biyosensörlerin Kullanımı Endojen ATP veya H belirlememize<sub&gt; 2</sub&gt; O<sub&gt; 2</sub&gt; Böbrek

Enzymatic microelectrode biosensors have been widely used to measure extracellular signaling in real-time. Most of their use has been limited to brain ...

Development of an Insert Co-culture System of Two Cellular Types in the Absence of Cell-Cell Contact

Hücre-Hücre İletişim Yokluğunda iki Hücresel Türleri Ekleme Co-kültür Sisteminin Geliştirilmesi

The role of secreted soluble factors in the modification of cellular responses is a recurrent theme in the study of all tissues and systems. In an attempt ...

The Use of Ex Vivo Whole-organ Imaging and Quantitative Tissue Histology to Determine the Bio-distribution of Fluorescently Labeled Molecules

The Use of Ex Vivo Whole-organ Imaging and Quantitative Tissue Histology to Determine the Bio-distribution of Fluorescently Labeled Molecules

Kullanımı<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Tüm organ Görüntüleme ve Kantitatif Doku Histoloji floresan etiketli Moleküllerin Biyo-dağılımını belirlemek için

Fluorescent labeling is a well-established process for examining the fate of labeled molecules under a variety of experimental conditions both in vitro ...