Name: freezing and thawing human embryonic stem cells
Uploaded: 2009-12-24T13:00:00
Duration: 8 min 49 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Freezing and Thawing Human Embryonic Stem Cells at JoVE.com

1. ذوبان الخلايا HES قبل انشاء التجريبية <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> قبل يوم واحد لخلايا HES ذوبان الجليد ، لوحة طبقة من الخلايا الليفية التغذية الماوس الجنينية المشع (MEF) ، CF1 سلالة ، وكذلك على واحد من الجيلاتين المغلفة جيدا 6 - نسيج لوحة الثقافة في مستنبت MEF (D MEM المتوسطة تستكمل مع القاعدية 10 ٪ الحرارة المعطل FBS و 1 ٪ غير الأحماض الأمينية الأساسية). يحضن بين عشية وضحاها على 37 درجة مئوية و 5 ٪ CO 2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> قبل إزالة الخلايا HES من النتروجين السائل ، يجب التأكد من أن جميع المعدات اللازمة والكواشف في مكان وعلى استعداد لاستخدامها لضمان وجود تحسن كفاءة ونجاحا. </li></ol> ذوبان للخلايا HES <ol start="3" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة القارورة المبردة من الخلايا HES من خزان النتروجين السائل التخزين باستخدام الملقط المعدني. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لفة القارورة بين يدي القفاز لمدة 3-5 ثانية لإزالة الصقيع. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تسجيل المعلومات على التسمية من القارورة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> باستخدام الملقط المعدني ، اغمس القارورة في حمام ماء C ° 37. دوامة القارورة بلطف ومراقبة التقدم المحرز في ذوبان الجليد في كثير من الأحيان (ولكن بسرعة!) من خلال عقد القارورة إلى الضوء لمعرفة حجم الكريستال الجليد. لا تغمره غطاء قنينة من الماء في الحمام لأن ذلك قد يلوث الخلايا. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> فقط عندما بلورة الجليد الصغيرة لا تزال ، يغرق القنينة بأكملها في الايثانول لتعقيم. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> في خزانة السلامة البيولوجية العقيمة ، ونقل محتويات القارورة المبردة مباشرة إلى أسفل أنبوب مخروطي 15 مل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة ببطء 4 مل من خلية HES مستنبت (D-MEM/F-12 المتوسطة القاعدية تستكمل مع خروج المغلوب استبدال 20 ٪ المصل ، 1 ٪ غير الأحماض الأمينية الأساسية ، 1 ٪ L - الجلوتامين ، 0.2 ٪ β - المركابتويثانول و 4 نانوغرام / bFGF مل) في أنبوب. بلطف لمزج موسيقى الروك باستمرار الخلايا كما يتم إضافة هذه الوسيلة الجديدة للأنبوب. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الطرد المركزي الخلايا لمدة 5 دقائق في غرام × 200 </li></ol> طلاء للخلايا HES <ol start="11" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> في حين أن خلايا HES في جهاز الطرد المركزي ، وإعداد لوحة العلامات التي المغذية MEF مع المعلومات المناسبة الخلية HES : خط الخلية ، ورقم المرور ، وتاريخ ذوبان الجليد. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> عندما يكون هناك ما يقرب من 2 دقائق من انتهاء الوقت على زيادة ونقصان ، ونضح مستنبت MEF وإضافة 1.0 مل من برنامج تلفزيوني إلى البئر. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تقديم مكعبات الخلايا HES يعود الى مجلس الوزراء السلامة البيولوجية ، ونضح بعناية طاف. يجب الحرص على عدم نضح الخلية بيليه ، ولكن كما طاف إزالة أكبر قدر ممكن ، وهذا الحل يتضمن DMSO المتوسطة من التجمد. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعادة تعليق بيليه بلطف جدا عن طريق إضافة 2.5 مل من خلية HES مستنبت زجاجي باستخدام الماصة 5 مل وpipetting 3-4 مرات. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نضح في برنامج تلفزيوني من وحدة التغذية MEF جيدا وإضافة ببطء كل ​​مل 2.5 من نظام التعليق الخلية HES للاستعداد جيدا لوحة 6 - جيدا. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع لوحة في الحاضنة 37 درجة مئوية والشريحة بعناية لوحة الأمام إلى الخلف ، وجنبا إلى جنب لتوزيعها بالتساوي على الخلايا في جميع أنحاء البئر. دوامة لا لوحة في نمط دائري لتجنب التركيز على المستعمرات في المركز. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> السماح للخلايا لنعلق على 37 درجة مئوية و 5 ٪ CO 2 بين عشية وضحاها. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد يوم من ذوبان الجليد ، وإزالة المتوسطة (مع أية خلايا التعويم) وإضافة 2.5 مل من خلية جديدة HES مستنبت إلى البئر. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> اختياري : يمكن نقل المتوسطة وإزالة الخلايا لوحة منفصلة أعدت MEF المغذية. هذه الخطوة بإنشاء مستعمرات جديدة في كثير من الأحيان يمكن أن يكون المثقف بالتوازي مع الخلايا من ذوبان الجليد الأصلي. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> احتضان لوحات عند 37 درجة مئوية و 5 ٪ CO 2 بين عشية وضحاها. </li></ol> 2. تجميد خلايا HES <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> في حين أن خلايا HES هي في أجهزة الطرد المركزي ، تسمية قارورة المبردة داخل مجلس الوزراء السلامة البيولوجية ، بما في ذلك خط الخلية ، ورقم المرور ، وتاريخ التجميد. كثافة نموذجي للخلايا HES تجميد هي واحدة من الخلايا بشكل جيد (من لوحة 6 أيضا) في القارورة المبردة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> عندما يتم الانتهاء من الخلايا HES الطرد المركزي ، ليصبح أنابيب العودة الى مجلس الوزراء السلامة البيولوجية. وطاف نضح من الأنبوب ، والحرص على عدم تعكير صفو فضفاضة معبأة الخلية بيليه. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend بيليه في الخلية التي تحتوي على كمية مناسبة من خلية HES مستنبت : 0.5 مل الخلية HES مستنبت في القارورة المبردة. أن يكون لطيف للغاية عندما pipetting ، والخلايا على نحو أفضل عندما HES استرداد القطع المجمدة في مستعمرة كبيرة نسبيا. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ببطء ، في حين تهز برفق الأنبوب ، إضافة إلى مبلغ مناسب (0.5 مل لكل cryovial) من الخلية 2X HES تجميد المتوسطة (60 ٪ FBS محددة ، و 20 ٪ ثقافة الخلية HES المتوسطة ، و 20 ٪ DMSO) إلى الخلايا. بمجرد إضافة المتوسطة التجميد ، الماصة الحل بلطف بالغ 1-2 مرات لالمزيج. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بسرعة ولكن بلطف ، إضافة 1 مل من خلية إلى تعليق كل قارورة المبردة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نقل قوارير في وعاء تجميد الأيزوبروبانول ووضعه فيa المجمد -80 درجة مئوية خلال الليل. سيتم تجميد الخلايا في 1 درجة مئوية في الدقيقة الواحدة في حاوية تجميد الأيزوبروبانول. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> في اليوم التالي ، ونقل بسرعة القنينات المجمدة إلى خزان النتروجين السائل التخزين باستخدام الملقط المعدني. </li></ol> ممثل النتائج في اليوم الأول بعد إذابة الخلايا ES الإنسان ، قد مستعمرات صغيرة شفافة وتظهر قد يكون من الصعب أن نرى تحت المجهر. منذ خلايا ES إذابة حديثا تميل إلى تتكاثر ببطء ، فإنها قد يستغرق بضعة أيام لتظهر كما أنشأت مستعمرات (الشكل 1). الشكل 1. وقد التقط الانتعاش والنمو الخلية. إذابة الخلايا HES من النيتروجين السائل 1 و 7 و 11 يوما بعد الذوبان.

<ol>
	<li>Freshney, R. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Culture of Animal Cells: A Manual of Basic Technique. , (2005).</li><li>Thomson, J. A., Itskovitz-Eldor, J., Shapiro, S. S., Waknitz, M. A., Swiergiel, J. J., Marshall, V. S., Jones, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Embryonic+stem+cell+lines+derived+from+human+blastocysts.">Embryonic stem cell lines derived from human blastocysts.</a> Science. 282 (5391), 1145-1147 (1998).</li></ol>

شريط الفيديو المرافق يوضح طريقة للذوبان وتجميد الخلايا HES. يجب إذابة خلايا مجمدة في النيتروجين السائل حمام بأسرع وقت ممكن للحصول على الانتعاش أفضل وجه ممكن. تذكر أن نكون حذرين للغاية عندما pipetting الخلايا ذوبان : تقليل التعامل مع الخلايا وماصة بلطف. يمكن مطلي قارورة واحدة من الخلايا HES على أي واحد أيضا من لوحة 6 - جيدا ، أو كل من الآبار لوحة 4 - جيدا وعلى الفور وضعت في الحاضنة. منذ زرع في أربع آبار منفصلة يقلل من احتمال فقدان ثقافة كاملة للتلوث ، ويجعل من الاسهل لتحديد موقع الخلية HES المستعمرات على مساحتها أقل ، فمن المستحسن لوحة 4 - جيدا عندما يذوب الخلايا HES للمرة الأولى. اليوم الأول بعد ذوبان الخلايا HES ، مستعمرات صغيرة وربما تكون شفافة. تجديد الثقافة الخلية HES المتوسط ​​كل يوم ، حتى لو كانت المستعمرات ليست واضحة تحت المجهر منذ ان الامر قد يستغرق بضعة أيام في الثقافة لخلايا HES لتظهر كما أنشأت مستعمرات. من المهم أن استخدام التغذية MEF مطلية حديثا طبقة الخلايا عند ذوبان الجليد ، والمستعمرات في كثير من الأحيان لا تصل إلى حجم مناسب لالركض حتى يوم 12 10 بعد ذوبان الجليد. عندما يذوب قارورة مرور منخفض من خلايا HES ، ومن الممارسات الجيدة لتوسيع وتجميد قارورة إضافية للحفاظ على المخزون من الخلايا مرور منخفض للثقافة والتجارب في المستقبل. كما أنها فكرة جيدة لتجميد جميع صحي روتيني &quot;إضافية&quot; للحفاظ على خلايا HES الأسهم المجمدة. وقد جمدت يذوب أنجح والثقافات اللاحقة كما عالية الجودة ، وغير متمايزة ، وتقسيم المستعمرات بنشاط الخلية HES. خلايا HES التعافي من تجميد أكثر فعالية إذا ما تم تناوله برفق والمجاميع الكبيرة الخلية. يجب أن يكون حجم الكلي النهائي ستكون مماثلة (أو أكبر قليلا من) حجم الركام مطلي بعد مرور روتينية.

<!DOCTYPE html PUBLIC "-//W3C//DTD XHTML 1.0 Transitional//EN" "http://www.w3.org/TR/xhtml1/DTD/xhtml1-transitional.dtd">
<html xmlns="http://www.w3.org/1999/xhtml" xml:lang="en" lang="en">	
		
		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>D-MEM</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>11965-092</td>
<td>For MEF mediumjavascript:void(0);</td>
</tr>
<tr>
<td>Fetal Bovine Serum (FBS), Certified</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>16000-044</td>
<td>Heat-inactivated 
For MEF medium</td>
</tr>
<tr>
<td>D-MEM/F-12</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>11330-057</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Knockout Serum Replacement</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>10828-028</td>
<td>Pre-screen to ensure support of hES cells</td>
</tr>
<tr>
<td>bFGF</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Stemgent</td>
<td>03-0002</td>
<td>Use at [4 ng/mL] final</td>
</tr>
<tr>
<td>Non-essential Amino Acids</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>11140-050</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>L-glutamine</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>25030-081</td>
<td>200 mM (100X) 
Use at [1X] final</td>
</tr>
<tr>
<td>PBS</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>14190-250</td>
<td>Without Ca2+ or Mg2+</td>
</tr>
<tr>
<td>Collagenase IV</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>17104-019</td>
<td>Make a fresh solution at 1 mg/mL in D-MEM/F-12</td>
</tr>
<tr>
<td>Gelatin</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>G1890</td>
<td>Type A, Porcine</td>
</tr>
<tr>
<td>DMSO</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>D2560</td>
<td>For freezing medium</td>
</tr>
<tr>
<td>Fetal Bovine Serum (FBS), Defined</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>HyClone</td>
<td>SH300.70.01</td>
<td>For freezing medium</td>
</tr>
<tr>
<td>6-well plates</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Nunc</td>
<td>140675</td>
<td>For general culture</td>
</tr>
<tr>
<td>4-well plates</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Nunc</td>
<td>176740</td>
<td>For thawing</td>
</tr>
<tr>
<td>5 mL glass pipettes</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fisher</td>
<td>13-678-27E</td>
<td>Individually wrapped</td>
</tr>
<tr>
<td>15 mL conical tubes</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Corning</td>
<td>430052</td>
<td>Polypropylene</td>
</tr>
<tr>
<td>Cryogenic vials</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Nunc</td>
<td>5000-1020</td>
<td>1.5 mL capacity</td>
</tr>
<tr>
<td>Freezing container</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Nalgene</td>
<td>5100-0001</td>
<td>&#x201C;Mr. Frosty&#x201D;</td>
</tr>		</tbody>
		</table>
		</div>

freezing and thawing human embryonic stem cells

منذ جيمس طومسون<em&gt; وآخرون</em&gt; تطوير تقنية في عام 1998 لعزل وتنمو HES في الثقافة ، وتصبح خلايا لاستخدامها لاحقا تجميد والذوبان ، وتوسيع الخلايا من الأوراق المالية المجمدة الاجراءات الهامة التي أجريت في خلية ثقافة HES الروتينية. منذ HES خلايا حساسة للغاية لتؤكد للتجميد والذوبان ، يجب توخي الحذر خاصة. نحن هنا لشرح الطريقة المناسبة لإذابة الخلايا بسرعة HES من المخزونات النيتروجين السائل ، والطلاء لهم على الخلايا الجنينية الماوس المغذية ، وتجميد ببطء لهم على المدى الطويل التخزين.

Watch this Scientific Journal Video about Freezing and Thawing Human Embryonic Stem Cells at JoVE.com

Freezing and Thawing Human Embryonic Stem Cells

منذ جيمس طومسون وآخرون تطوير تقنية في عام 1998 لعزل وتنمو HES في الثقافة ، وتصبح خلايا لاستخدامها لاحقا تجميد والذوبان ، وتوسيع الخلايا من الأوراق المالية المجمدة الاجراءات الهامة التي أجريت في خلية ثقافة HES الروتينية. منذ HES خلايا حساسة للغاية لتؤكد للتجميد والذوبان ، يجب توخي الحذر خاصة. نحن هنا لشرح الطريقة المناسبة لإذابة الخلايا بسرعة HES من المخزونات النيتروجين السائل ، والطلاء لهم على الخلايا الجنينية الماوس المغذية ، وتجميد ببطء لهم على المدى الطويل التخزين.

تجميد والذوبان الخلايا الجذعية الجنينية البشرية

Since James Thomson et al developed a technique in 1998 to isolate and grow hES in culture, freezing cells for later use and thawing and expanding cells ...

Research

JoVE Journal

Biology

Freezing Human ES Cells

تجميد الخلايا البشرية ES

Here we demonstrate how our lab freezes HuES human embryonic stem cell lines.  A healthy, exponentially expanding culture is washed with PBS to remove ...

Propagation of Human Embryonic Stem (ES) Cells

Propagation of Human Embryonic Stem ES Cells

انتشار الخلايا الجنينية البشرية (ES) الجذعية

Derivation of Hematopoietic Stem Cells from Murine Embryonic Stem Cells

اشتقاق خلايا الجذعية المكونة للدم من الفئران خلايا الجذعية الجنينية

A stem cell is defined as a cell with the capacity to both self-renew and generate multiple differentiated progeny.  Embryonic stem cells (ESC) are ...

Derivation of Human Embryonic Stem Cells by Immunosurgery

اشتقاق الخلايا الجذعية الجنينية البشرية التي Immunosurgery

The ability of human embryonic stem cells to self-renew and differentiate into all cell types of 
the body suggests that they hold great promise for both ...

Probing for Mitochondrial Complex Activity in Human Embryonic Stem Cells

سبر للنشاط مجمع الميتوكوندريا في خلايا المنشأ الجنينية البشرية

Mitochondria are cytoplasmic organelles that have a primary role in cellular metabolism and homeostasis, regulation of the cell signaling network, and ...

Freezing, Thawing, and Packaging Cells for Transport

تجميد والذوبان ، وخلايا تغليف للنقل

Cultured mammalian cells are used extensively in cell biology studies. It requires a number of special skills in order to be able to preserve the ...

Chromatin Immunoprecipitation from Human Embryonic Stem Cells

مناعي لونين من الخلايا الجذعية الجنينية البشرية

The functional and structural complexity of the myriad of cells in metazoan organisms arises from a small number of stem cells. Stem cells are ...

Culture and Maintenance of Human Embryonic Stem Cells  

الثقافة والمحافظة على الخلايا الجذعية الجنينية البشرية

Human embryonic stem (hES) cells must be monitored and cared for in order to maintain healthy, undifferentiated cultures. At minimum, the cultures must be ...

Chromosomal Spread Preparation of Human Embryonic Stem Cells for Karyotyping

الكروموسومات التحضير انتشار الخلايا الجذعية الجنينية البشرية لKaryotyping

Although human embryonic stem cells (hESC) have been shown to present a stable diploid karyotype 1, many studies have reported that depending on culture ...

Differentiation of Embryonic Stem Cells into Oligodendrocyte Precursors

تمايز الخلايا الجذعية الجنينية في السلائف Oligodendrocyte

Oligodendrocytes are the myelinating cells of the central nervous system. For regenerative cell therapy in demyelinating diseases, there is significant ...