Name: a technique to simultaneously visualize virus-specific cd8+ t cells and virus-infected cells in situ
Uploaded: 2009-08-13T12:00:00
Duration: 20 min 47 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Technique to Simultaneously Visualize Virus-Specific CD8+ T Cells and Virus-Infected Cells In situ at JoVE.com

אנו מודים ג&#39;Sedgewick לסיוע בהקמת מיקרוסקופ confocal ללכוד תמונות של גרגרי כסף; נתמך בחלקו על ידי מענקי מחקר NIH AI48484 (ATH), AI20048 (ע&quot;ר), ו AI066314 (CJM); המרכז הלאומי לחקר משאבי מענק. RR00169 (CNPRC, מאוניברסיטת קליפורניה, דייוויס).

<ol>
	<li>Altman, J. D., Moss, P. A. H., Goulder, P. J. R., Barouch, D. H., McHeyzer-Williams, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phenotypic+analysis+of+antigen-specific+T+lymphocytes.">Phenotypic analysis of antigen-specific T lymphocytes.</a> Science. 274, 94-96 (1996).</li><li>Skinner, P. J., Daniels, M. A., Schmidt, C. S., Jameson, S. C., Haase, A. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cutting+Edge:+In+situ+tetramer+staining+of+antigen-specific+T+cells+in+tissues.">Cutting Edge: In situ tetramer staining of antigen-specific T cells in tissues.</a> Journal of Immunology. 165, 617-61 (2000).</li><li>Qingsheng, L. i., Skinner, P. J., Ha, S. -. J., Duan, L., Mattila, T., Hage, A., White, C., Barber, D. L., O'mara, L., Southern, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualizing+antigen-specific+and+infected+cells+in+situ+predicts+outcome+in+early+viral+infection.">Visualizing antigen-specific and infected cells in situ predicts outcome in early viral infection.</a> Science. 323, 1726-1729 (2008).</li><li>Haase, T., Haase, K., Zupancic, M., Sedgewick, G., Faust, R. A., Melroe, H., Cavert, W., Gebhard, K., Staskus, K., Zhang, Z. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Perelson+Quantitative+Image+Analysis+of+HIV-1+Infection+in+Lymphoid+Tissue.">Perelson Quantitative Image Analysis of HIV-1 Infection in Lymphoid Tissue.</a> Science. 274, 985-989 (1996).</li><li>Li, Q., Duan, L., Estes, J. D., Ma, Z. M., Rourke, T., Wang, Y., Reilly, C., Carlis, J., Miller, C. J., Haase, A. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Peak+SIV+replication+in+resting+memory+CD4+T+cells+depletes+gut+lamina+propria+CD4+T+cells.">Peak SIV replication in resting memory CD4 T cells depletes gut lamina propria CD4 T cells.</a> Nature. 434, 1148-1152 (2005).</li><li>Li, Q. i. n. g. s. h. e. n. g., Estes, J. a. c. o. b. D., Schlievert, P. a. t. r. i. c. k. M., Duan, L. i. j. i. e., Brosnahan, A. m. a. n. d. a. J., Southern, P. e. t. e. r. J., Reilly, C. a. v. a. n. S., Peterson, M. a. r. n. i. e. L., Schultz-Darken, N. a. n. c. y., Brunner, K. e. v. i. n. G., Nephew, K. a. r. l. a. R., Pambuccian, S. t. e. f. a. n., Lifson, J. e. f. f. r. e. y. D., &amp;amp, J. o. h. n. V. C. a. r. l. i. s., Haase, A. s. h. l. e. y. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glycerol+monolaurate+prevents+mucosal+SIV+transmission.">Glycerol monolaurate prevents mucosal SIV transmission.</a> Nature. , (2009).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

מאז נגיף RNA משמש כסמן תאים הנגועים בנגיף בדוח זה, כל ריאגנטים לפני הכלאה צריכים להיות חופשיים RNAase. בהליך הכלאה באתרו המתואר כאן שונתה כדי לשמר את האות ניאון מ ב מכתים tetramer באתרה. מאז האות radioautographic מ הנגועים בנגיף תאים זוהה על ידי הכלאה ב באתרו הוא בעומק של בערך בקוטר-תאים, בסעיפים עבה המשמש ב מכתים tetramer באתרו להיות חתכה מחדש תוך 5-8 מיקרון בעובי חלקים. זו טכניקה חדשנית של שילוב של tetramers באתרו של הכלאה באתרו (ISTH) המתואר כאן מאפשר מיפוי להדמיה סימולטני, וניתוח הקשר המרחבי של וירוס ספציפי בתאי CD8 + T ו-נגוע בווירוס התאים היעד. שיטה זו יכולה להיות מיושמת על מנת להעריך CD8 + T תא החיסון מבוסס על נגיף פתוגן שאינו אחרים ואת האינטראקציות המארח. שיטת ניתוח התמונה שתוארה כאן יכול להיות גם מותאם המחקר יחסים מרחביים של כל שני תאים אוכלוסיות אינטראקציה באתרו, למשל, אנחנו לאחרונה השתמשו הליך מיפוי centroid בלימוד של העברת HIV-1 המינית במודל פרימטים לא אנושיים של חסר חיסוני הקופי זיהום וירוס של קופי רזוס 6

פתרונות ריאגנטים: <ul style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> PBS-H פוספט שנאגרו הפרין המכיל תמיסת מלח (100ug/ml או 18.7U/ml) לעכב RNASes </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תרבות RPMI רקמות מדיה המכילה הפרין (100ug/ml או 18.7U/ml) לעכב RNASes </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 4% נמוך להמיס agarose ב PBS </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> PBS עם סרום 2% עז רגילה (או בסרום ממינים שבה נוגדנים מצומדות fluorophore נעשו). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> PBS עם סרום 2% עז נורמלי טריטון 0.3% X-100 </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בכיתה MHC אני tetramers מצומדות כדי FITC </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Anti-FITC נוגדנים, למשל Biodesign ארנבת אנטי FITC </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מצומדות Fluorophore נגד ארנב IgG כי כבר מאוד לחצות adsorbed למינים אחרים IgG לשימוש עם תיוג מרובות, למשל עזים נגד ארנב Cy3 </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מצומדות Fluorophore אנטי עכבר IgG כי כבר מאוד לחצות adsorbed למינים אחרים IgG לשימוש עם תיוג מרובים </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> טרי PBS שנאגרו paraformaldehyde 4% </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 0.01M דשן </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> גליצרול / הג&#39;לטין המכיל 4mg/ml n-propyl gallate </li></ul> ציוד מיוחד <ul style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Vibratome </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אזמל נתוחים </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> סכיני גילוח </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כירורגי מספריים </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Loctite הגדר מהירה מיידית דבק (מוצר # 46551) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מצבטים </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> # 2 מברשות צבע שיער גמלים. אפשר לקשט עם סכין גילוח לעובי הרצוי </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 24 גם שטוח רקמה תחתית תרבות צלחות למשל פלקון קטלוג # 353226 </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לתאי רקמות </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> טין לסכל </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תיקיית קרטון שקופיות למשל פישר קטלוג # 12-587-10 </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Confocal מיקרוסקופ </li></ul> IST ריאגנטים לעיון מהיר PBS-H (פוספט בופר סליין עם הפרין) <ul style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 450 מ&quot;ל 1X PBS </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 50 מ&quot;ל 1X PBS + הפרין 10X </li></ul> 1x PBS + הפרין 10X <ul style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 500 מ&quot;ל 1X PBS </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 500 מ&quot;ג אבקת הפרין (נמצא על המדף כימי יבש אחסון) </li></ul> NGS PBS-H / 2% (עז נורמלי בסרום) <ul style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 49 מ&quot;ל PBS-H של פלקון צינור </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 1 מ&quot;ל NGS (נמצאו 1 aliquots מ&quot;ל במקפיא -20) </li></ul> NGS PBS-H / 2% / 0.3% Triton X-100 <ul style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 49 מ&quot;ל PBS-H / טריטון 0.3% X-100 ב פלקון צינור </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 1 מ&quot;ל NGS (נמצאו 1 aliquots מ&quot;ל במקפיא -20) </li></ul> PBS-H / 0.3% Triton X-100 <ul style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 500 מ&quot;ל PBS-H </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 1.5 מ&quot;ל טריטון X-100 (זהו נוזל סמיך למצוא על מדפי אחסון יבש כימי) </li></ul> 4% LMP agarose <ul style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 2 גרם אבקת LMP agarose </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 50 מ&quot;ל PBS </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Shake עד מיקרוגל, מעורב עד להמסת האבקה. </li></ul> GG-NPG (גליצרול ג&#39;לטין עם n-propyl galate <ul style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים בקבוק של גליצרול ג&#39;לטין באמבט 50 מעלות מים כדי להמיס </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 0.06 גר &#39;של propyl galate (נמצא על המדף טריס), לנער היטב </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שמור באמבט מים, רועד מדי פעם עד שהיא נמסה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Aliquot לתוך צינורות 1 מ&quot;ל (צינורות חום) </li></ul> 4% paraformaldehyde <ul style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 4 גרם אבקת paraformaldehyde (נמצא על המדפים אחסון יבש כימי) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שים על 10 מ&quot;ל PBS-H בתוך גליל סיימה, להוסיף אבקת PF </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מוסיפים מעט מים עד נפח מגיע לכ 70 מ&quot;ל </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף אחת של טפטפת NaOH. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מערבבים עד שהיא נמסה (בדרך כלל כ - 20-30 דקות) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף HCl עד pH מגיע בין 7-8. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תביאו נפח 100 מ&quot;ל מים. </li></ul> דשן 0.01 מ &#39; <ul style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 0.3 גרם אוריאה (נמצא על מדפי אחסון יבש כימי) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 500 מ&quot;ל מים </li></ul>

a technique to simultaneously visualize virus-specific cd8+ t cells and virus-infected cells in situ

המספרים של הנגיף במקומות ספציפיים CD8 + T תאים ביחס מספרים ומיקומים של מטרות נגועים שלהם התא נחשב קריטי בקביעת התוצאות אשר נע בין פינוי מתמשך לזיהומים כרוניים. אנו מתארים כאן שיטה להערכת יחסים מרחביים כמותיים בין החיסון מפעיל (ה) וירוס ספציפי CD8 + T תאים מטרות נגוע (T) אשר משלב מכתים באתרו (IST) tetramer לזהות וירוסים ספציפיים CD8 + T תאים ו באתרו ההכלאה (שאני עורך) כדי לזהות נגיפי-RNA + תאים ברקמות שם את הקרב בין ההגנה החיסונית וזיהום מתרחש. השילוב של מכתים IST ו - איש, מקוצר ISTH, מאפשרת הדמיה ומיפוי של המיקומים של תאים מפעיל מטרות החיסונית, ונחישות קליל של E: יחסי טי. פרמטרים אלה בתורם לאחר מכן ניתן להשתמש כדי לקבוע את יחסי הגומלין בין קרבה מרחבית, ואת העיתוי ואת העוצמה של התגובה החיסונית כי לחזות תוצאות של זיהום מוקדם.

Watch this Scientific Journal Video about A Technique to Simultaneously Visualize Virus-Specific CD8+ T Cells and Virus-Infected Cells In situ at JoVE.com

A Technique to Simultaneously Visualize Virus-Specific CD8+ T Cells and Virus-Infected Cells In situ

טכניקה המשלבת ב מכתים tetramer באתרו של הכלאה באתרו (ISTH) מאפשר, הדמיית מיפוי וניתוח של הקרבה המרחבי של ספציפיים וירוס CD8 תאים + T ליעדים הנגועים בנגיף שלהם, וקביעת היחסים הכמותיים בין effectors מטרות החיסונית לתוצאות זיהום.

טכניקה במקביל דמיינו ספציפיות וירוס CD8 + T ו-תאים הנגועים בווירוס תאים באתרו</em

The numbers and locations of virus-specific CD8+ T cells relative to the numbers and locations of their infected cell targets is thought to be critical in ...

Research

JoVE Journal

Biology

A Technique to Simultaneously Visualize Virus-Specific CD8+ T Cells and Virus-Infected Cells In situ

Regulatory T cells: Therapeutic Potential for Treating Transplant Rejection and Type I Diabetes

רגולציה T תאים: הפוטנציאל הטיפולי לטיפול דחייה וסוג אני סוכרת

Homing of Hematopoietic Cells to the Bone Marrow

ביות של תאים hematopoietic אל מח העצם

Homing is the phenomenon whereby transplanted hematopoietic cells are able to travel to and engraft or establish residence in the bone marrow.  Various ...

Isolation of Valvular Endothelial Cells

בידוד של תאים אנדותל valvular

Heart valves are solely responsible for maintaining unidirectional blood flow through the cardiovascular system.  These thin, fibrous tissues are ...

Clonogenic Assay: Adherent Cells

Assay Clonogenic: תאים חסיד

The clonogenic (or colony forming) assay has been established for more than 50 years; the original paper describing the technique was published in 19561. ...

Lineage Labeling of Zebrafish Cells with Laser Uncagable Fluorescein Dextran

Lineage תיוג של תאים דג הזברה עם לייזר Uncagable והעמסת dextran

A central problem in developmental biology is to deduce the origin of the myriad cell types present in vertebrates as they arise from undifferentiated ...

Induction and Analysis of Epithelial to Mesenchymal Transition

אינדוקציה וניתוח של אפיתל לmesenchymal מעבר

Epithelial  to mesenchymal transition (EMT) is essential for proper morphogenesis during  development. Misregulation of this  process has been implicated ...

Nephrotoxin Microinjection in Zebrafish to Model Acute Kidney Injury

Nephrotoxin Microinjection דג הזברה למודל אי-ספיקת כליות חריפה

The kidneys are susceptible to harm from exposure to chemicals they filter from the bloodstream. This can lead to organ injury associated with a rapid ...

A Graphical User Interface for Software-assisted Tracking of Protein Concentration in Dynamic Cellular Protrusions

ממשק משתמש גרפי למעקב בסיוע תוכנה של ריכוז חלבון בהפרעות ניידות דינמיות

Filopodia are dynamic, finger-like cellular protrusions associated with migration and cell-cell communication. In order to better understand the complex ...

In Situ Immunofluorescent Staining of Autophagy in Muscle Stem Cells

In Situ Immunofluorescent Staining of Autophagy in Muscle Stem Cells

ב Situ Immunofluorescent מכתים של autophagy בתאי גזע שריר

Increasing evidence points to autophagy as a crucial regulatory process to preserve tissue homeostasis. It is known that autophagy is involved in skeletal ...

Confocal Imaging of Neuropeptide Y-pHluorin: A Technique to Visualize Insulin Granule Exocytosis in Intact Murine and Human Islets

קונאפוקלית הדמיה של Neuropeptide Y-pHluorin: טכניקה להמחיש אינסולין אקסוציטוזה גרגר ב איונים מאתר ואנושי ללא פגע

Insulin secretion plays a central role in glucose homeostasis under normal physiological conditions as well as in disease. Current approaches to study ...