Name: a technique to simultaneously visualize virus-specific cd8+ t cells and virus-infected cells in situ
Uploaded: 2009-08-13T12:00:00
Duration: 20 min 47 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Technique to Simultaneously Visualize Virus-Specific CD8+ T Cells and Virus-Infected Cells In situ at JoVE.com

Мы благодарим J. Седжвик за помощь в создании конфокальной микроскопии для захвата изображения зерен серебра; при частичной поддержке грантов NIH AI48484 (ATH), AI20048 (РА), а AI066314 (CJM); Национальный центр по изучению ресурсов гранта. RR00169 (CNPRC, Университет Калифорнии, Дэвис).

<ol>
	<li>Altman, J. D., Moss, P. A. H., Goulder, P. J. R., Barouch, D. H., McHeyzer-Williams, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phenotypic+analysis+of+antigen-specific+T+lymphocytes.">Phenotypic analysis of antigen-specific T lymphocytes.</a> Science. 274, 94-96 (1996).</li><li>Skinner, P. J., Daniels, M. A., Schmidt, C. S., Jameson, S. C., Haase, A. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cutting+Edge:+In+situ+tetramer+staining+of+antigen-specific+T+cells+in+tissues.">Cutting Edge: In situ tetramer staining of antigen-specific T cells in tissues.</a> Journal of Immunology. 165, 617-61 (2000).</li><li>Qingsheng, L. i., Skinner, P. J., Ha, S. -. J., Duan, L., Mattila, T., Hage, A., White, C., Barber, D. L., O'mara, L., Southern, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualizing+antigen-specific+and+infected+cells+in+situ+predicts+outcome+in+early+viral+infection.">Visualizing antigen-specific and infected cells in situ predicts outcome in early viral infection.</a> Science. 323, 1726-1729 (2008).</li><li>Haase, T., Haase, K., Zupancic, M., Sedgewick, G., Faust, R. A., Melroe, H., Cavert, W., Gebhard, K., Staskus, K., Zhang, Z. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Perelson+Quantitative+Image+Analysis+of+HIV-1+Infection+in+Lymphoid+Tissue.">Perelson Quantitative Image Analysis of HIV-1 Infection in Lymphoid Tissue.</a> Science. 274, 985-989 (1996).</li><li>Li, Q., Duan, L., Estes, J. D., Ma, Z. M., Rourke, T., Wang, Y., Reilly, C., Carlis, J., Miller, C. J., Haase, A. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Peak+SIV+replication+in+resting+memory+CD4+T+cells+depletes+gut+lamina+propria+CD4+T+cells.">Peak SIV replication in resting memory CD4 T cells depletes gut lamina propria CD4 T cells.</a> Nature. 434, 1148-1152 (2005).</li><li>Li, Q. i. n. g. s. h. e. n. g., Estes, J. a. c. o. b. D., Schlievert, P. a. t. r. i. c. k. M., Duan, L. i. j. i. e., Brosnahan, A. m. a. n. d. a. J., Southern, P. e. t. e. r. J., Reilly, C. a. v. a. n. S., Peterson, M. a. r. n. i. e. L., Schultz-Darken, N. a. n. c. y., Brunner, K. e. v. i. n. G., Nephew, K. a. r. l. a. R., Pambuccian, S. t. e. f. a. n., Lifson, J. e. f. f. r. e. y. D., &amp;amp, J. o. h. n. V. C. a. r. l. i. s., Haase, A. s. h. l. e. y. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glycerol+monolaurate+prevents+mucosal+SIV+transmission.">Glycerol monolaurate prevents mucosal SIV transmission.</a> Nature. , (2009).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

Так как вирус РНК используется в качестве маркера для инфицированных вирусом клеток в настоящем докладе, все реагенты до гибридизации должно быть РНКазой бесплатно. На месте процедуру гибридизации описаны здесь был изменен, чтобы сохранить флуоресцентный сигнал на месте окрашиванием тетрамера. С радиоавтографического сигнал от зараженных вирусами-клетки обнаружены на месте гибридизация на глубине около одной ячейке диаметра, толстым слоем используются для окрашивания на месте тетрамер должны перекроить в 5-8-микронной толщины секций. Этот новый метод объединения на месте тетрамеров и гибридизация (ISTH) описаны здесь позволяет одновременно визуализации, отображения и анализа пространственных отношений вирус-специфических CD8 + T-клеток и инфицированные вирусом клетки-мишени. Этот метод может быть применен для оценки CD8 + Т-клеток, основанных вакцины и в других, не вирус возбудителя и принимающих взаимодействий. Метод анализа изображений, описанные здесь также может быть адаптировано для изучения пространственных отношений любых двух клеточных популяций взаимодействующих на месте, например, мы недавно использовали центроида процедуры отображения в изучении ВИЧ-1 половым путем в приматах модели обезьяньего иммунодефицита вирусная инфекция макак-резус 6

Решения и реактивы: <ul><li> PBS-H фосфат солевой буфер содержащие гепарин (100ug/ml или 18.7U/ml) для ингибирования РНКазы </li><li> RPMI культуре ткани среды, содержащие гепарин (100ug/ml или 18.7U/ml) для ингибирования РНКазы </li><li> 4% низкой расплава агарозы в ФСБ </li><li> PBS с 2% нормальной козьей сывороткой (или сыворотки от вида, в котором флуорофора конъюгированных антител не было). </li><li> PBS с 2% нормальной козьей сывороткой и 0,3% тритона Х-100 </li><li> MHC класса I тетрамеров конъюгированные с FITC </li><li> Анти-FITC антител, например биодизайна кроличьих анти-FITC </li><li> Флуорофора сопряженных анти-IgG кролика, который был высоко перекрестно адсорбированных на другие виды IgG для использования с несколькими маркировки, например, коза-анти-кролик-Cy3 </li><li> Флуорофора сопряженных анти-IgG мыши, которая была высоко перекрестно адсорбированных на другие виды IgG для использования с несколькими маркировки </li><li> Свежий PBS буфером 4% параформальдегида </li><li> 0,01 М мочевиной </li><li> Глицерин / желатин содержащие 4mg/ml н-пропил галлат </li></ul> Специальное оборудование <ul><li> Vibratome </li><li> Скальпель </li><li> Лезвия для бритвы </li><li> Хирургические ножницы </li><li> Быстрый Loctite клей мгновенного Set (продукт # 46551) </li><li> Щипцы </li><li> # 2 верблюда кисти волосы краской. Может отделкой с лезвием для желаемой толщины </li><li> 24-луночных плоскодонных культуре ткани пластин например Сокол каталога # 353226 </li><li> Ткань камер </li><li> Оловянной фольги </li><li> Картонные папки, например, слайд Фишер каталога # 12-587-10 </li><li> Конфокальной микроскопии </li></ul> IST Реагенты Краткий справочник PBS-H (фосфатным буферным солевым раствором с гепарином) <ul><li> 450 мл 1X PBS </li><li> 50 мл 1X PBS + 10X гепарин </li></ul> 1x PBS + 10X гепарин <ul><li> 500 мл 1X PBS </li><li> 500 мг гепарина порошок (находится на сухой стеллажного хранения химических) </li></ul> PBS-H / 2% NGS (обычный козел сыворотка) <ul><li> 49 мл PBS-Н Сокол трубки </li><li> 1 мл NGS (находится в 1 мл аликвоты в -20 морозильная камера) </li></ul> PBS-H / 2% NGS / 0,3% Triton X-100 <ul><li> 49 мл PBS-H / 0,3% Тритон Х-100 в Сокол трубки </li><li> 1 мл NGS (находится в 1 мл аликвоты в -20 морозильная камера) </li></ul> PBS-H / 0,3% Triton X-100 <ul><li> 500 мл PBS-H </li><li> 1,5 мл Тритон Х-100 (это густая жидкость найти на полках сухого хранения химических) </li></ul> 4% LMP агарозном <ul><li> 2 г порошка LMP агарозном </li><li> 50 мл PBS </li><li> Встряска, пока смешанные, микроволновая печь, пока порошок не растворится. </li></ul> GG-НПГ (глицерин, желатин с н-пропил galate <ul><li> Место бутылку глицерина желатин в 50 градусов водяной бане растопить </li><li> Добавить 0,06 г пропил galate (находится на Террис полка), хорошо взболтайте </li><li> Имейте в водяной бане, встряхивая время от времени до полного растворения. </li><li> Алиготе в 1 мл пробирок (коричневый труб) </li></ul> 4% параформальдегида <ul><li> 4 г параформальдегида порошок (находится на сухой полки хранения химических) </li><li> Положите около 10 мл PBS-H в мерный цилиндр, добавить порошок р </li><li> Добавьте немного воды, пока объем составляет около 70 мл </li><li> Добавьте одну капельница NaOH. </li><li> Перемешать до полного растворения (обычно около 20-30 минут) </li><li> Добавить HCl до рН достигает 7-8. </li><li> Довести объем до 100 мл воды. </li></ul> Мочевина 0,01 М <ul><li> 0,3 г мочевины (находится на сухой полки хранения химических) </li><li> 500 мл воды </li></ul>

a technique to simultaneously visualize virus-specific cd8+ t cells and virus-infected cells in situ

Количества и местонахождения вирус-специфических CD8 + T-клеток относительно количества и местонахождения их инфицированных цели ячейка считается критическим для определения результатов, которые варьируются от оформления к хроническому стойких инфекций. Мы опишем здесь метод оценки пространственных и количественных соотношений между иммунной эффекторной (E) вирус-специфических CD8 + Т-клеток и инфицированных мишеней (Т), которая объединяет на месте тетрамер (IST) окрашивания для выявления вирус-специфических CD8 + T-клеток и на месте гибридизация (МОГ) для обнаружения вирусной РНК +-клеток в тканях, где сражение между иммунной и инфекция имеет место. Сочетание окрашивания IST и ISH, сокращенно ISTH, дает возможность визуализации и отображения местах иммунных клеток-эффекторов и задач, а поверхностное определение E: T отношений. Эти параметры в свою очередь, могут быть использованы для определения отношений между пространственной близости, а также сроки и величина иммунного ответа, что предсказать результаты в начале инфекции.

Watch this Scientific Journal Video about A Technique to Simultaneously Visualize Virus-Specific CD8+ T Cells and Virus-Infected Cells In situ at JoVE.com

A Technique to Simultaneously Visualize Virus-Specific CD8+ T Cells and Virus-Infected Cells In situ

Техника объединения на месте окрашивания тетрамера и гибридизация (ISTH) позволяет визуализации, отображения и анализа пространственной близости вирус-специфических CD8 + Т-клеток с их инфицированных вирусом цели, а также определение количественных соотношений между этими иммунных эффекторов и задач к инфекции результатов.

Техника одновременно визуализировать вирус-специфических CD8 + T-клетки и инфицированные вирусом клетки В месте</em

The numbers and locations of virus-specific CD8+ T cells relative to the numbers and locations of their infected cell targets is thought to be critical in ...

Research

JoVE Journal

Biology

A Technique to Simultaneously Visualize Virus-Specific CD8+ T Cells and Virus-Infected Cells In situ

Regulatory T cells: Therapeutic Potential for Treating Transplant Rejection and Type I Diabetes

Регуляторных Т-клеток: терапевтический потенциал для лечения Отказ трансплантации и I типа диабета

Homing of Hematopoietic Cells to the Bone Marrow

Homing гемопоэтических клеток в костном мозге

Homing is the phenomenon whereby transplanted hematopoietic cells are able to travel to and engraft or establish residence in the bone marrow.  Various ...

Isolation of Valvular Endothelial Cells

Выделение клапанные эндотелиальных клеток

Heart valves are solely responsible for maintaining unidirectional blood flow through the cardiovascular system.  These thin, fibrous tissues are ...

Clonogenic Assay: Adherent Cells

Клоногенных Пробирной: прилипшие клетки

The clonogenic (or colony forming) assay has been established for more than 50 years; the original paper describing the technique was published in 19561. ...

Lineage Labeling of Zebrafish Cells with Laser Uncagable Fluorescein Dextran

Lineage Маркировка данио рерио Клетки с лазерной Uncagable Fluorescein Декстран

A central problem in developmental biology is to deduce the origin of the myriad cell types present in vertebrates as they arise from undifferentiated ...

Induction and Analysis of Epithelial to Mesenchymal Transition

Индукционные и анализ эпителиальных к мезенхимальных перехода

Epithelial  to mesenchymal transition (EMT) is essential for proper morphogenesis during  development. Misregulation of this  process has been implicated ...

Nephrotoxin Microinjection in Zebrafish to Model Acute Kidney Injury

Nephrotoxin Микроинъекция в данио рерио к модели острое повреждение почек

The kidneys are susceptible to harm from exposure to chemicals they filter from the bloodstream. This can lead to organ injury associated with a rapid ...

A Graphical User Interface for Software-assisted Tracking of Protein Concentration in Dynamic Cellular Protrusions

Графический пользовательский интерфейс для отслеживания концентрации белка в программном сопровождении в динамических клеточных выпячиваниях

Filopodia are dynamic, finger-like cellular protrusions associated with migration and cell-cell communication. In order to better understand the complex ...

In Situ Immunofluorescent Staining of Autophagy in Muscle Stem Cells

In Situ Immunofluorescent Staining of Autophagy in Muscle Stem Cells

In Situ Иммунофлуоресцентное окрашивание аутофагии в мышечных клетках

Increasing evidence points to autophagy as a crucial regulatory process to preserve tissue homeostasis. It is known that autophagy is involved in skeletal ...

Confocal Imaging of Neuropeptide Y-pHluorin: A Technique to Visualize Insulin Granule Exocytosis in Intact Murine and Human Islets

Конфокальный изображений нейропептида Y-pHluorin: техника для визуализации экзоцитоз гранул инсулина в нетронутыми мышиных и человеческих островках

Insulin secretion plays a central role in glucose homeostasis under normal physiological conditions as well as in disease. Current approaches to study ...