Name: extraction of high molecular weight genomic dna from soils and sediments
Uploaded: 2009-11-10T20:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Extraction of High Molecular Weight Genomic DNA from Soils and Sediments at JoVE.com

We willen graag de Canadese Stichting voor Innovatie, de British Columbia Kennis Development Fund, Genome British Columbia en de British Columbia Ministerie van Bossen en Range bedanken voor de ondersteuning van lopende studies van de bosbodem productiviteit. SL werd ondersteund door een beurs van de TULA basis gefinancierd Centrum voor Microbiële diversiteit en evolutie.

Deel I: Extractie van DNA Procedure 1. 8 uur nodig zijn, voor de verwerking van zes monsters met uitzondering van de kwantificering van DNA. Voordat u begint met de winning, dan moet u vooraf-chill mortier, de stamper en spatel in een -20 ° C vriezer of met behulp van vloeibare stikstof. Ook pre-chill 50 ml buisjes met 20 ml chloroform isoamylalcohol (24:1) op ijs. Zet de hybridisatie oven voor op 65 ° C te verwarmen....

<ol>
	<li>Hurt, R. A., Qiu, X., Wu, L., Roh, Y., Palumbo, A. V., Tiedje, J. M., Zhou, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+recovery+of+RNA+and+DNA+from+soils+and+sediments.">Simultaneous recovery of RNA and DNA from soils and sediments.</a> AEM. 67 (10), 4495-4503 (2001).</li><li>Wright, J. J., Lee, S., Zaikova, E., Walsh, D. A., Hallam, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+extraction+from+0.22+&#956;M+Sterivex+filters+and+cesium+chloride+density+gradient+centrifugation.">DNA extraction from 0.22 &#956;M Sterivex filters and cesium chloride density gradient centrifugation.</a> JoVE. , (2009).</li><li>Taupp, M., Lee, S., Hawley, A., Yang, J., Hallam, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Large+insert+environmental+genomic+library+production.">Large insert environmental genomic library production.</a> J Vis Exp. , (2009).</li></ol>

Recept * Denatureren oplossing 4 M Guanidine isothiocyanate 10 mM Tris-HCl (pH 7,0) 1 mM EDTA 0,5% 2-mercapto-ethanol <table border="0" style="font-size:9pt; width:400px;"><tr><td colspan="2"> Denatureren oplossing: 10 ml in totaal </td></tr><tr><td> Guanidine isothiocyanaat (MW 118,16) </td><td> 4,73 g </td></tr><tr><td> 1 M Tris-HCl (pH 7,0) </td><td> 100 pi </td></tr><tr><td> 0,5 M EDTA </td><td> 20 pl </td></tr><tr><td colspan="2"> Voeg water toe tot 9,95 ml in totaal. </td></tr><tr><td colspan="2"> Autoclaaf. </td></tr><tr><td colspan="2"> Voeg 50 pi 2-mercapto-ethanol vlak voor gebruik. (5 ul van 2-mercapto-ethanol per 1 ml denatureren Solution) Let op: Houd de denaturering oplossing bij 4 ° C. Gebruik geen buffer ouder dan een week. Indien mogelijk, het maken van verse buffer te gebruiken. </td></tr></table> ** Extractiebuffer 100 mM natriumfosfaat buffer [pH 7,0] 100 mM Tris-HCl [pH 7,0] 100 mM EDTA [pH 8,0] 1,5 M NaCl 1% Hexadecyltrimethylammonium bromide (CTAB) 2% SDS <table border="0" style="font-size:9pt; width:400px;"><tr><td colspan="2"> Extractiebuffer voor 1 L in totaal </td></tr><tr><td> 1M natriumfosfaatbuffer [pH 7,0] * </td><td> 100 ml </td></tr><tr><td> 1 M Tris-HCl [pH 7,0] </td><td> 100 ml </td></tr><tr><td> 0,5 M EDTA [pH 8,0] </td><td> 200 ml </td></tr><tr><td> 5 M NaCl </td><td> 300 ml </td></tr><tr><td colspan="2"> Autoclaaf en bewaren bij kamertemperatuur. </td></tr><tr><td colspan="2"> Voeg 200 ml, 5% Hexadecyltrimethylammonium bromide (CTAB, geautoclaveerd) en 100 ml, 20% SDS (autoclaaf) net vóór gebruik. Als CTAB werd gekristalliseerd, het smelt bij 60 ° C. * 1M natriumfosfaatbuffer: 57,7 ml, 1M natrium monobasisch (NaH 2 PO 4) en 42,3 ml, 1M Dibasisch (NaH 2 PO 4). Pas de pH tot 7,0 Let op: Gebruik geen 20% SDS als deze neerslag. Het is normaal om te zien melkachtige suspensie als je SDS toe te voegen aan de oplossing. Zodra u SDS, plaatst de extractie buffer bij 60 ° C om ervoor te zorgen SDS is goed opgeschort. </td></tr></table>

extraction of high molecular weight genomic dna from soils and sediments

De bodem microbioom is een groot en relatief onontgonnen reservoir van genomische diversiteit en metabole innovatie die nauw is verbonden met voedingsstoffen en energie stromen binnen terrestrische ecosystemen. Teelt-onafhankelijke milieu-genoom, ook wel bekend als metagenomic, benaderingen beloven een ongekende toegang tot deze genetische informatie met betrekking tot de pad wederopbouw en functionele screening voor hoogwaardige therapeutische en biomassa conversie processen. Echter, de bodem microbioom blijft nog steeds een uitdaging grotendeels te wijten aan de moeilijkheid bij het verkrijgen van een hoog moleculair gewicht DNA van voldoende kwaliteit zijn voor grote insert bibliotheek productie. Hier introduceren we een protocol voor de extractie van een hoog moleculair gewicht, microbiële gemeenschap genomisch DNA uit bodems en sedimenten. De kwaliteit van de geïsoleerde genomisch DNA is ideaal voor de aanleg van grote insert milieu genome bibliotheken voor downstream-sequencing en screening toepassingen. De procedure begint met cel lysis. Celwanden en membranen van micro-organismen worden gelyseerd door zowel mechanische (slijpen) en chemische krachten (β-mercapto-ethanol). Genomisch DNA wordt vervolgens geïsoleerd met behulp extractiebuffer, chloroform-isoamylalcohol en isopropyl alcohol. De buffers gebruikt voor de lysis en de winning stappen omvatten guanidine isothiocyanaat en hexadecyltrimethylammonium bromide (CTAB) om de integriteit van het hoge moleculair gewicht genomisch DNA te behouden. Afhankelijk van uw downstream toepassing, kan het geïsoleerde genomisch DNA verder worden gezuiverd met behulp van cesium chloride (CSCL) gradiënt ultracentrifugatie, die verontreinigingen, zoals humuszuren vermindert. De eerste procedure, extractie, duurt ongeveer acht uur, met uitzondering van DNA kwantificering stap. De CsCl gradiënt ultracentrifugatie, is een proces van twee dagen. Gedurende de gehele procedure, genomisch DNA moet voorzichtig behandeld worden om afschuiven te voorkomen, te vermijden ernstige vortexen, en repetitieve hard pipetteren.

Watch this Scientific Journal Video about Extraction of High Molecular Weight Genomic DNA from Soils and Sediments at JoVE.com

Extraction of High Molecular Weight Genomic DNA from Soils and Sediments

Een methodiek om hoog moleculair gewicht en de hoge kwaliteit van genomisch DNA te isoleren uit de bodem microbiële gemeenschap wordt beschreven.

Extractie met een hoog molecuulgewicht Genomic DNA uit bodems en sedimenten

The soil microbiome is a vast and relatively unexplored reservoir of genomic diversity and metabolic innovation that is intimately associated with ...

Research

JoVE Journal

Biology

Isolation of Genomic DNA from Mouse Tails

Isolatie van Genomic DNA van muis Tails

DNA Extraction from 0.22 &mu;M Sterivex Filters and Cesium Chloride Density Gradient Centrifugation

DNA Extraction from 0.22 ÃƒÅ½Ã‚Â¼M Sterivex Filters and Cesium Chloride Density Gradient Centrifugation

DNA-extractie van 0,22 uM Sterivex Filters en Cesium Chloride dichtheidsgradiënt centrifugatie

This method is used to extract high molecular weight genomic DNA from planktonic biomass concentrated on 0.22 &mu;M Sterivex filters that have been ...

Using the GELFREE 8100 Fractionation System for Molecular Weight-Based Fractionation with Liquid Phase Recovery

Met behulp van de GELFREE 8100 Fractionering System for Molecular Weight-Based Fractionering met Liquid Phase Recovery

The GELFREE 8100 Fractionation System is a novel protein fractionation system designed to maximize protein recovery during molecular weight based ...

Generation of RNA/DNA Hybrids in Genomic DNA by Transformation using RNA-containing Oligonucleotides

Genereren van RNA / DNA-Hybriden in Genomic DNA door omzetting door middel RNA-bevattende Oligonucleotiden

Synthetic short nucleic acid polymers, oligonucleotides (oligos), are the most functional and widespread tools of molecular biology. Oligos can be ...

Genomic MRI - a Public Resource for Studying Sequence Patterns within Genomic DNA

Genomische MRI - een openbare hulpbron voor het bestuderen van Sequence patronen binnen Genomic DNA

Non-coding genomic regions in complex eukaryotes, including intergenic areas, introns, and untranslated segments of exons, are profoundly non-random in ...

DNA Extraction from Paraffin Embedded Material for Genetic and Epigenetic Analyses

DNA-extractie van paraffine Embedded materiaal voor genetische en epigenetische Analyses

Disease development and progression are characterized by frequent genetic and epigenetic aberrations including chromosomal rearrangements, copy number ...

Extraction of High Molecular Weight DNA from Microbial Mats

Extractie met een hoog molecuulgewicht DNA van microbiële matten

Successful and accurate analysis and interpretation of metagenomic data is dependent upon the efficient extraction  of high-quality, high molecular weight ...

A Practical and Novel Method to Extract Genomic DNA from Blood Collection Kits for Plasma Protein Preservation

Een praktische en nieuwe methode om Genomic DNA Uittreksel uit Bloedafname Kits voor Plasma Protein Preservation

Laboratory tests can be done on the cellular or  fluid portions of the blood. The use of different blood collection tubes  determines the portion of the ...

Selective Capture of 5-hydroxymethylcytosine from Genomic DNA

Selectieve vangen van 5-hydroxymethylcytosine van genomisch DNA

5-methylcytosine (5-mC) constitutes ~2-8% of the total cytosines in human genomic DNA and impacts a broad range of biological functions, including gene ...

Amplification, Next-generation Sequencing, and Genomic DNA Mapping of Retroviral Integration Sites

Versterking, next-generation sequencing en Genomic DNA in kaart brengen van retrovirale integratie Sites

Retroviruses exhibit signature integration preferences on both the local and global scales. Here, we present a detailed protocol for (1) generation of ...