Name: extraction of high molecular weight genomic dna from soils and sediments
Uploaded: 2009-11-10T20:30:00
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Nous tenons à remercier la Fondation canadienne pour l&#39;innovation, la Colombie-Britannique, de développement des connaissances du Fonds, Génome Colombie-Britannique et la British Columbia Ministry of Forests and Range de soutenir les études en cours sur la productivité des sols forestiers. SL a été soutenu par une bourse de la Fondation du Centre TULA financé pour la diversité microbienne et évolution.

Partie I: Extraction d&#39;ADN Procédure 1. 8 heures sont nécessaires, pour le traitement des 6 échantillons excluant la quantification de l&#39;ADN. Avant de commencer l&#39;extraction, vous aurez besoin de pré-froid de mortier, un pilon et une spatule dans un congélateur à -20 ° C ou en utilisant l&#39;azote liquide. En outre, pré-froid des tubes de 50 ml contenant 20 ml de chloroforme alcool isoamylique (24:1...

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	<li>Hurt, R. A., Qiu, X., Wu, L., Roh, Y., Palumbo, A. V., Tiedje, J. M., Zhou, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+recovery+of+RNA+and+DNA+from+soils+and+sediments.">Simultaneous recovery of RNA and DNA from soils and sediments.</a> AEM. 67 (10), 4495-4503 (2001).</li><li>Wright, J. J., Lee, S., Zaikova, E., Walsh, D. A., Hallam, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+extraction+from+0.22+&#956;M+Sterivex+filters+and+cesium+chloride+density+gradient+centrifugation.">DNA extraction from 0.22 &#956;M Sterivex filters and cesium chloride density gradient centrifugation.</a> JoVE. , (2009).</li><li>Taupp, M., Lee, S., Hawley, A., Yang, J., Hallam, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Large+insert+environmental+genomic+library+production.">Large insert environmental genomic library production.</a> J Vis Exp. , (2009).</li></ol>

Recette * Solution dénaturante 4 M Guanidine isothiocyanate 10 mM Tris-HCl (pH 7,0) EDTA 1 mM 0,5% de 2-mercaptoéthanol <table border="0" style="font-size:9pt; width:400px;"><tr><td colspan="2"> Solution de dénaturation: 10 ml au total </td></tr><tr><td> Isothiocyanate de guanidine (MW 118.16) </td><td> 4,73 g </td></tr><tr><td> 1M Tris-HCl (pH 7,0) </td><td> 100 ul </td></tr><tr><td> EDTA 0,5 M </td><td> 20 pl </td></tr><tr><td colspan="2"> Ajouter de l&#39;eau à 9,95 ml au total. </td></tr><tr><td colspan="2"> Autoclave. </td></tr><tr><td colspan="2"> Ajouter 50 ul de 2-mercaptoéthanol juste avant utilisation. (5 ul de 2-mercaptoéthanol par 1 ml Solution dénaturation) Remarque: Conservez la solution dénaturante à 4 ° C. Ne pas utiliser de tampon plus d&#39;une semaine. Si possible, faire tampon frais d&#39;utilisation. </td></tr></table> Tampon d&#39;extraction ** 100 mM de tampon phosphate de sodium [pH 7,0] 100 mM Tris-HCl [pH 7,0] 100 mM d&#39;EDTA [pH 8,0] 1,5 M de NaCl Bromure de Hexadecyltrimethylammonium 1% (CTAB) 2% de SDS <table border="0" style="font-size:9pt; width:400px;"><tr><td colspan="2"> Tampon d&#39;extraction pour 1 litre au total </td></tr><tr><td> Sodium 1M tampon phosphate [pH 7,0] * </td><td> 100 ml </td></tr><tr><td> Tris-HCl 1M [pH 7,0] </td><td> 100 ml </td></tr><tr><td> 0,5 M EDTA [pH 8,0] </td><td> 200 ml </td></tr><tr><td> 5 M de NaCl </td><td> 300 ml </td></tr><tr><td colspan="2"> Autoclave et le conserver à température ambiante. </td></tr><tr><td colspan="2"> Ajouter 200ml, le bromure Hexadecyltrimethylammonium 5% (CTAB, autoclave) et 100 ml, 20% de SDS (autoclave) juste avant utilisation. Si CTAB a été cristallisé, le faire fondre à 60 ° C. * Buffer phosphate de sodium 1M: 57,7 ml, de sodium 1M phosphate monobasique (NaH 2 PO 4) et 42,3 ml, 1 M phosphate de sodium dibasique (NaH 2 PO 4). Ajuster le pH à 7,0 Note: Ne pas utiliser 20% de SDS si elle a des précipitations. Il est normal de voir la suspension laiteuse quand vous ajoutez à la solution de SDS. Une fois que vous ajoutez SDS, placer le tampon d&#39;extraction à 60 ° C pour assurer la SDD est ainsi suspendu. </td></tr></table>

extraction of high molecular weight genomic dna from soils and sediments

Le microbiome sol est un réservoir vaste et relativement inexploré de la diversité génomique et l&#39;innovation métabolique qui est intimement associé à des éléments nutritifs et flux d&#39;énergie dans les écosystèmes terrestres. La culture indépendante génomique environnementale, aussi connu comme métagénomique, les approches promets un accès sans précédent à cette information génétique à l&#39;égard de la reconstruction et la voie de criblage fonctionnel à des fins thérapeutiques de grande valeur et des processus de conversion de la biomasse. Toutefois, le microbiome sol reste encore un défi largement dû à la difficulté d&#39;obtenir un ADN de haut poids moléculaire d&#39;une qualité suffisante pour la production d&#39;insérer grande bibliothèque. Ici, nous introduisons un protocole pour l&#39;extraction de haut poids moléculaire, l&#39;ADN génomique microbienne communauté de sols et les sédiments. La qualité de l&#39;ADN génomique isolé est idéal pour la construction de grands insertion environnementale des banques génomiques pour des applications de séquençage et de dépistage en aval. La procédure débute par la lyse cellulaire. Les parois cellulaires et les membranes des microbes sont lysées par les deux forces mécaniques (broyage) et chimiques (β-mercaptoéthanol). L&#39;ADN génomique est ensuite isolé en utilisant un tampon d&#39;extraction, le chloroforme-alcool isoamylique et d&#39;alcool isopropylique. Les tampons utilisés pour la lyse et des étapes d&#39;extraction comprennent isothiocyanate de guanidine et le bromure de hexadécyltriméthylammonium (CTAB) pour préserver l&#39;intégrité de l&#39;ADN génomique de haut poids moléculaire. Selon votre application en aval, l&#39;ADN génomique isolé peut être davantage purifiée en utilisant du chlorure de césium (CsCl) ultracentrifugation en gradient, ce qui réduit les impuretés, notamment des acides humiques. La première procédure, l&#39;extraction, il faut environ 8 heures, à l&#39;exclusion étape quantification de l&#39;ADN. L&#39;ultracentrifugation en gradient de CsCl, est un processus en deux jours. Pendant toute la procédure, l&#39;ADN génomique devrait être traitée en douceur pour éviter le cisaillement, éviter les vortex sévère et répétitif pipetage rudes.

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Extraction of High Molecular Weight Genomic DNA from Soils and Sediments

Une méthodologie pour isoler de haut poids moléculaire et de haute qualité à partir de l&#39;ADN génomique des communautés microbiennes du sol est décrite.

Extraction d&#39;ADN de haut poids moléculaire génomique par les sols et sédiments

The soil microbiome is a vast and relatively unexplored reservoir of genomic diversity and metabolic innovation that is intimately associated with ...

Research

JoVE Journal

Biology

Isolation of Genomic DNA from Mouse Tails

Isolement de l&#39;ADN génomique de souris Tails

Recherche

Biologie

DNA Extraction from 0.22 &mu;M Sterivex Filters and Cesium Chloride Density Gradient Centrifugation

DNA Extraction from 0.22 ÃƒÅ½Ã‚Â¼M Sterivex Filters and Cesium Chloride Density Gradient Centrifugation

Extraction de l&#39;ADN à partir de 0,22 Filtres Sterivex uM et le césium Centrifugation gradient de chlorure de densité

This method is used to extract high molecular weight genomic DNA from planktonic biomass concentrated on 0.22 &mu;M Sterivex filters that have been ...

Using the GELFREE 8100 Fractionation System for Molecular Weight-Based Fractionation with Liquid Phase Recovery

Utiliser le système de fractionnement GELFREE 8100 pour les Poids Moléculaire à base de fractionnement avec récupération de la phase liquide

The GELFREE 8100 Fractionation System is a novel protein fractionation system designed to maximize protein recovery during molecular weight based ...

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Génération d&#39;ADN / ARN hybrides d&#39;ADN génomique par la transformation en utilisant l&#39;ARN contenant Oligonucléotides

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Une méthode pratique et roman d&#39;extraire l&#39;ADN génomique à partir de kits de prélèvement sanguin pour la préservation Plasma Protein

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5-methylcytosine (5-mC) constitutes ~2-8% of the total cytosines in human genomic DNA and impacts a broad range of biological functions, including gene ...

Amplification, Next-generation Sequencing, and Genomic DNA Mapping of Retroviral Integration Sites

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Retroviruses exhibit signature integration preferences on both the local and global scales. Here, we present a detailed protocol for (1) generation of ...