Name: extraction of high molecular weight genomic dna from soils and sediments
Uploaded: 2009-11-10T20:30:00
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Wir möchten den kanadischen Stiftung für Innovation, der British Columbia Knowledge Development Fund, Genome British Columbia und der British Columbia Ministry of Forests und Range für die Unterstützung laufender Studien der Waldboden Produktivität danken. SL wurde durch ein Stipendium von der Stiftung finanziert TULA Zentrum für Mikrobielle Diversität und Evolution unterstützt.

Teil I: Die Extraktion von DNA Verfahren 1. 8 Stunden benötigt werden, für die Verarbeitung von 6 Proben ohne Quantifizierung von DNA. Bevor Sie die Extraktion zu starten, werden Sie vor Kälte Mörtel, Pistill und Spatel in einem -20 ° C Gefrierschrank oder mit flüssigem Stickstoff benötigen. Auch vor Kälte 50 ml Röhrchen mit 20 ml Chloroform Isoamylalkohol (24:1) auf Eis. Stellen Sie die Hybridisierung Backofen...

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	<li>Hurt, R. A., Qiu, X., Wu, L., Roh, Y., Palumbo, A. V., Tiedje, J. M., Zhou, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+recovery+of+RNA+and+DNA+from+soils+and+sediments.">Simultaneous recovery of RNA and DNA from soils and sediments.</a> AEM. 67 (10), 4495-4503 (2001).</li><li>Wright, J. J., Lee, S., Zaikova, E., Walsh, D. A., Hallam, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+extraction+from+0.22+&#956;M+Sterivex+filters+and+cesium+chloride+density+gradient+centrifugation.">DNA extraction from 0.22 &#956;M Sterivex filters and cesium chloride density gradient centrifugation.</a> JoVE. , (2009).</li><li>Taupp, M., Lee, S., Hawley, A., Yang, J., Hallam, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Large+insert+environmental+genomic+library+production.">Large insert environmental genomic library production.</a> J Vis Exp. , (2009).</li></ol>

Rezept * Denaturierungslösung 4 M Guanidin-Isothiocyanat 10 mM Tris-HCl (pH 7,0) 1 mM EDTA 0,5% 2-Mercaptoethanol <table border="0" style="font-size:9pt; width:400px;"><tr><td colspan="2"> Denaturierenden Lösung: 10 ml in insgesamt </td></tr><tr><td> Guanidinisothiocyanat (MW 118,16) </td><td> 4,73 g </td></tr><tr><td> 1M Tris-HCl (pH 7,0) </td><td> 100 ul </td></tr><tr><td> 0,5 M EDTA </td><td> 20 pl </td></tr><tr><td colspan="2"> Fügen Sie Wasser auf 9,95 ml insgesamt. </td></tr><tr><td colspan="2"> Autoclave. </td></tr><tr><td colspan="2"> Dann werden 50 ul 2-Mercaptoethanol kurz vor Gebrauch. (5 ul 2-Mercaptoethanol pro 1 ml Denaturierungslösung) Hinweis: Halten Sie die Denaturierung Lösung bei 4 ° C. Verwenden Sie keine Puffer älter als eine Woche. Wenn möglich, machen frischem Puffer zu verwenden. </td></tr></table> ** Extraktionspuffer 100 mM Natrium-Phosphat-Puffer [pH 7,0] 100 mM Tris-HCl [pH 7,0] 100 mM EDTA [pH 8,0] 1,5 M NaCl 1% Hexadecyltrimethylammoniumbromid (CTAB) 2% SDS <table border="0" style="font-size:9pt; width:400px;"><tr><td colspan="2"> Extraktionspuffer für 1 L in insgesamt </td></tr><tr><td> 1M Natrium-Phosphat-Puffer [pH 7,0] * </td><td> 100 ml </td></tr><tr><td> 1M Tris-HCl [pH 7,0] </td><td> 100 ml </td></tr><tr><td> 0,5 M EDTA [pH 8,0] </td><td> 200 ml </td></tr><tr><td> 5 M NaCl </td><td> 300 ml </td></tr><tr><td colspan="2"> Autoclave und halten Sie sie bei Raumtemperatur. </td></tr><tr><td colspan="2"> Add 200 ml, 5% Hexadecyltrimethylammoniumbromid (CTAB, autoklaviert) und 100 ml, 20% SDS (autoklaviert) unmittelbar vor dem Gebrauch. Wenn CTAB wurde kristallisiert, schmilzt es bei 60 ° C. * 1M Natrium-Phosphat-Puffer: 57,7 ml, 1M Mononatriumphosphat (NaH 2 PO 4) und 42,3 ml, 1M Natrium dibasisch (NaH 2 PO 4). Der pH-Wert auf 7,0 Hinweis: Verwenden Sie keine 20% SDS, wenn es Niederschläge. Es ist normal, milchige Suspension sehen, wenn Sie SDS hinzu, um die Lösung. Sobald Sie fügen SDS, platzieren Sie den Extraktionspuffer bei 60 ° C, um sicherzustellen, SDS gut aufgehängt ist. </td></tr></table>

extraction of high molecular weight genomic dna from soils and sediments

Der Boden Mikrobiom ist ein riesiges und relativ unerforscht Reservoir von genomischer Diversität und metabolische Innovation, die eng mit Nährstoff-und Energieflüsse innerhalb terrestrische Ökosysteme verbunden ist. Anbau-unabhängigen Umweltgutachter genomische, auch als Metagenom bekannt, versprechen Ansätze beispiellosen Zugang zu diesen genetischen Informationen in Bezug auf Weg Wiederaufbau und funktionelles Screening für hochwertige therapeutische und Umwandlung von Biomasse-Prozesse. Doch der Boden Mikrobiom immer noch eine Herausforderung vor allem auf die Schwierigkeiten bei der Beschaffung hochmolekulare DNA von ausreichender Qualität für große einfügen Bibliothek Produktion. Hier stellen wir ein Protokoll für die Gewinnung von hohem Molekulargewicht, mikrobiellen Gemeinschaft genomischer DNA aus Böden und Sedimenten. Die Qualität der isolierten genomischen DNA ist ideal für den Bau großer einfügen Umwelt genomische Bibliotheken für Downstream-Sequenzierung und Screening-Anwendungen. Das Verfahren beginnt mit Zell-Lyse. Zellwände und Membranen von Mikroben werden sowohl von mechanischen (Schleifen) und chemische Kräfte (β-Mercaptoethanol) lysiert. Genomic DNA wird dann isoliert mit Extraktionspuffer, Chloroform-Isoamylalkohol und Isopropylalkohol. Die Puffer für die Lyse und Extraktion Schritte eingesetzt werden, umfassen Guanidinisothiocyanat und Hexadecyltrimethylammoniumbromid (CTAB), um die Integrität der hochmolekularen genomische DNA zu erhalten. Abhängig von Ihrer nachgeschalteten Anwendung kann der isolierten genomischen DNA weiter aufgereinigt werden mit Cäsiumchlorid (CsCl)-Ultrazentrifugation, die Verunreinigungen einschließlich Huminsäuren reduziert. Das erste Verfahren, Extraktion, dauert ca. 8 Stunden, ohne DNA-Quantifizierung Schritt. Die CsCl Gradienten-Ultrazentrifugation, ist ein 2 Tage-Prozess. Während des gesamten Verfahrens, genomische DNA vorsichtig behandelt werden sollte, um Scherung zu verhindern, vermeiden Sie starke Verwirbelung und repetitive rauen Pipettieren.

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Extraction of High Molecular Weight Genomic DNA from Soils and Sediments

Eine Methodik, um mit hohem Molekulargewicht und hoher Qualität genomischer DNA aus mikrobiellen Gemeinschaft zu isolieren beschrieben.

Extraktion von High Molecular Weight genomischer DNA aus Böden und Sedimenten

The soil microbiome is a vast and relatively unexplored reservoir of genomic diversity and metabolic innovation that is intimately associated with ...

Research

JoVE Journal

Biology

Isolation of Genomic DNA from Mouse Tails

Isolierung genomischer DNA aus Maus-Tails

Forschung

Biologie

DNA Extraction from 0.22 &mu;M Sterivex Filters and Cesium Chloride Density Gradient Centrifugation

DNA Extraction from 0.22 ÃƒÅ½Ã‚Â¼M Sterivex Filters and Cesium Chloride Density Gradient Centrifugation

DNA-Extraktion von 0,22 pM Sterivex Filter und Cäsiumchlorid-Dichtegradientenzentrifugation

This method is used to extract high molecular weight genomic DNA from planktonic biomass concentrated on 0.22 &mu;M Sterivex filters that have been ...

Using the GELFREE 8100 Fractionation System for Molecular Weight-Based Fractionation with Liquid Phase Recovery

Mit dem GELFREE 8100 Fraktionierung System für Molecular Weight-Based Fraktionierung mit Liquid Phase Wiederherstellung

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