Name: extraction of high molecular weight genomic dna from soils and sediments
Uploaded: 2009-11-10T20:30:00
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Vorremmo ringraziare la Fondazione canadese per l&#39;innovazione, la Columbia Britannica Conoscenza di sviluppo regionale, Genome British Columbia e la British Columbia Ministero delle Foreste e Gamma per sostenere gli studi in corso di produttività del suolo forestale. SL è stato sostenuto da una borsa di studio del Centro TULA fondazione finanziata per la diversità microbica e Evolution.

Parte I: Estrazione del DNA Procedura 1. 8 ore sono tenuti, per l&#39;elaborazione di 6 campioni esclusi quantificazione del DNA. Prima di iniziare l&#39;estrazione, sarà necessario pre-chill mortaio, pestello e spatola in un congelatore di -20 ° C o con azoto liquido. Inoltre, pre-chill 50 ml provette contenenti 20 ml di cloroformio alcool isoamilico (24:1) su ghiaccio. Impostare il forno di ibridazione a 65 ° C per...

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	<li>Hurt, R. A., Qiu, X., Wu, L., Roh, Y., Palumbo, A. V., Tiedje, J. M., Zhou, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+recovery+of+RNA+and+DNA+from+soils+and+sediments.">Simultaneous recovery of RNA and DNA from soils and sediments.</a> AEM. 67 (10), 4495-4503 (2001).</li><li>Wright, J. J., Lee, S., Zaikova, E., Walsh, D. A., Hallam, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+extraction+from+0.22+&#956;M+Sterivex+filters+and+cesium+chloride+density+gradient+centrifugation.">DNA extraction from 0.22 &#956;M Sterivex filters and cesium chloride density gradient centrifugation.</a> JoVE. , (2009).</li><li>Taupp, M., Lee, S., Hawley, A., Yang, J., Hallam, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Large+insert+environmental+genomic+library+production.">Large insert environmental genomic library production.</a> J Vis Exp. , (2009).</li></ol>

Ricetta * Denaturazione soluzione 4 M guanidina isotiocianato 10 mM Tris-HCl (pH 7,0) 1 mM EDTA 0,5% 2-mercaptoetanolo <table border="0" style="font-size:9pt; width:400px;"><tr><td colspan="2"> Soluzione di denaturazione: 10 ml in totale </td></tr><tr><td> Guanidina isotiocianato (118,16 MW) </td><td> 4,73 g </td></tr><tr><td> 1M Tris-HCl (pH 7,0) </td><td> 100 ul </td></tr><tr><td> 0.5M EDTA </td><td> 20 l </td></tr><tr><td colspan="2"> Aggiungere acqua a 9,95 ml in totale. </td></tr><tr><td colspan="2"> Autoclave. </td></tr><tr><td colspan="2"> Aggiungere 50 microlitri 2-mercaptoetanolo appena prima dell&#39;uso. (5 ml di 2-mercaptoetanolo per 1 ml Soluzione di denaturazione) Nota: Conservare la soluzione di denaturazione a 4 ° C. Non utilizzare buffer di più di una settimana. Se possibile, fare tampone fresco da usare. </td></tr></table> ** Tampone di estrazione 100 mM di tampone fosfato di sodio [pH 7,0] 100 mM Tris-HCl [pH 7,0] 100 mM EDTA [pH 8,0] 1,5 M di NaCl Bromuro di esadeciltrimetilammonio 1% (CTAB) 2% SDS <table border="0" style="font-size:9pt; width:400px;"><tr><td colspan="2"> Tampone di estrazione per 1 L in totale </td></tr><tr><td> Tampone fosfato di sodio 1M [pH 7,0] * </td><td> 100 ml </td></tr><tr><td> 1M Tris-HCl [pH 7,0] </td><td> 100 ml </td></tr><tr><td> 0.5M EDTA [pH 8,0] </td><td> 200 ml </td></tr><tr><td> 5 M NaCl </td><td> 300 ml </td></tr><tr><td colspan="2"> Autoclave e tenerlo a temperatura ambiente. </td></tr><tr><td colspan="2"> Aggiungere 200 ml, il bromuro di esadeciltrimetilammonio 5% (CTAB, autoclavato) e 100 ml, 20% SDS (autoclave) subito prima dell&#39;uso. Se CTAB è stato cristallizzato, si fondono a 60 ° C. * 1M tampone fosfato di sodio: 57,7 ml di sodio 1M fosfato monobasico (NaH 2 PO 4) e 42,3 ml, 1M Fosfato di sodio bibasico (NaH 2 PO 4). Regolare il pH a 7,0 Nota: non utilizzare il 20% SDS se è precipitazioni. E &#39;normale vedere sospensione lattiginosa quando si aggiunge SDS alla soluzione. Una volta aggiunto SDS, posizionare il tampone di estrazione a 60 ° C per assicurare SDS è ben sospeso. </td></tr></table>

extraction of high molecular weight genomic dna from soils and sediments

Il microbioma suolo è un vasto serbatoio e relativamente inesplorato della diversità genomica e innovazione metabolici che è intimamente associato a sostanze nutritive e flusso di energia negli ecosistemi terrestri. Coltivazione indipendente genomica ambientale, noto anche come metagenomica, approcci promessa accesso senza precedenti a queste informazioni genetiche rispetto alla ricostruzione percorso di screening e funzionale a fini terapeutici ad alto valore e processi di conversione della biomassa. Tuttavia, il microbioma suolo rimane ancora una sfida in gran parte dovuta alla difficoltà di ottenere DNA di alta peso molecolare di qualità sufficiente per la produzione di grandi biblioteche inserire. Qui introduciamo un protocollo per l&#39;estrazione ad alto peso molecolare, DNA genomico comunità microbica da terreni e sedimenti. La qualità del DNA genomico isolato è ideale per la costruzione di grandi librerie di inserimento ambientale genomiche per applicazioni a valle di sequenziamento e di screening. La procedura inizia con la lisi cellulare. Pareti delle cellule e le membrane dei microbi vengono lisati da entrambe le forze meccaniche (rettifica) e chimici (β-mercaptoetanolo). Il DNA genomico viene poi isolato tramite tampone di estrazione, cloroformio-alcool isoamilico e alcool isopropilico. I tamponi utilizzati per la lisi e fasi di estrazione comprendono isotiocianato di guanidina e esadeciltrimetilammonio bromuro (CTAB) per preservare l&#39;integrità del DNA genomico ad alto peso molecolare del peso. A seconda dell&#39;applicazione a valle, il DNA genomico isolato può essere ulteriormente purificato con cloruro di cesio (CsCl) ultracentrifugazione gradiente, che riduce le impurità tra cui gli acidi umici. Il primo procedimento, l&#39;estrazione, dura circa 8 ore, escluse le passo la quantificazione del DNA. L&#39;ultracentrifugazione gradiente di CsCl, è un processo di due giorni. Durante l&#39;intera procedura, il DNA genomico deve essere trattata con delicatezza per evitare di taglio, evitare vortex severo, duro e ripetitivo pipettaggio.

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Extraction of High Molecular Weight Genomic DNA from Soils and Sediments

Una metodologia per isolare ad alto peso molecolare del DNA genomico e di alta qualità da parte della comunità microbica del suolo è descritta.

Estrazione di DNA ad alta peso molecolare genomico da terreni e sedimenti

The soil microbiome is a vast and relatively unexplored reservoir of genomic diversity and metabolic innovation that is intimately associated with ...

Research

JoVE Journal

Biology

Isolation of Genomic DNA from Mouse Tails

Isolamento del DNA genomico da Tails mouse

Ricerca

Biologia

DNA Extraction from 0.22 &mu;M Sterivex Filters and Cesium Chloride Density Gradient Centrifugation

DNA Extraction from 0.22 ÃƒÅ½Ã‚Â¼M Sterivex Filters and Cesium Chloride Density Gradient Centrifugation

Estrazione del DNA da 0,22 Filtri mM Sterivex e cloruro di Cesio densità centrifugazione gradiente

This method is used to extract high molecular weight genomic DNA from planktonic biomass concentrated on 0.22 &mu;M Sterivex filters that have been ...

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Utilizzando il sistema GELFREE 8100 Frazionamento per peso molecolare basata su Frazionamento con recupero della fase liquida

The GELFREE 8100 Fractionation System is a novel protein fractionation system designed to maximize protein recovery during molecular weight based ...

Generation of RNA/DNA Hybrids in Genomic DNA by Transformation using RNA-containing Oligonucleotides

Generazione di DNA / RNA ibrido nel DNA genomico da trasformazione utilizzando RNA contenenti oligonucleotidi

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Un metodo pratico e innovativo per estrarre il DNA genomico da kit di raccolta del sangue per Plasma Proteina Preservation

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Amplification, Next-generation Sequencing, and Genomic DNA Mapping of Retroviral Integration Sites

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Retroviruses exhibit signature integration preferences on both the local and global scales. Here, we present a detailed protocol for (1) generation of ...