Name: extraction of high molecular weight genomic dna from soils and sediments
Uploaded: 2009-11-10T20:30:00
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Nos gustaría agradecer a la Fundación Canadiense para la Innovación, de la Columbia Británica Fondo para el Desarrollo del Conocimiento, Genoma Columbia Británica y el British Columbia Ministerio de Bosques y de rango para el apoyo a los estudios en curso de la productividad del suelo forestal. SL fue apoyado por una beca de la Fundación Centro TULA financiado por la diversidad microbiana y la evolución.

Parte I: La extracción de ADN Procedimiento 1. 8 horas son necesarias, para el procesamiento de seis muestras de exclusión de la cuantificación de ADN. Antes de iniciar la extracción, tendrá que pre-chill mortero, mano de mortero y una espátula en un congelador a -20 ° C o el uso de nitrógeno líquido. Además, pre-frío tubos de 50 ml que contiene 20 ml de cloroformo alcohol isoamílico (24:1) en el hielo. Ajus...

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	<li>Hurt, R. A., Qiu, X., Wu, L., Roh, Y., Palumbo, A. V., Tiedje, J. M., Zhou, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+recovery+of+RNA+and+DNA+from+soils+and+sediments.">Simultaneous recovery of RNA and DNA from soils and sediments.</a> AEM. 67 (10), 4495-4503 (2001).</li><li>Wright, J. J., Lee, S., Zaikova, E., Walsh, D. A., Hallam, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+extraction+from+0.22+&#956;M+Sterivex+filters+and+cesium+chloride+density+gradient+centrifugation.">DNA extraction from 0.22 &#956;M Sterivex filters and cesium chloride density gradient centrifugation.</a> JoVE. , (2009).</li><li>Taupp, M., Lee, S., Hawley, A., Yang, J., Hallam, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Large+insert+environmental+genomic+library+production.">Large insert environmental genomic library production.</a> J Vis Exp. , (2009).</li></ol>

Receta * La desnaturalización solución 4 M guanidina isotiocianato 10 mM Tris-HCl (pH 7,0) 1 mM EDTA 0,5% 2-mercaptoetanol <table border="0" style="font-size:9pt; width:400px;"><tr><td colspan="2"> Solución de desnaturalización: 10 ml en total </td></tr><tr><td> Guanidina isotiocianato (118,16 MW) </td><td> 4,73 g </td></tr><tr><td> 1M Tris-HCl (pH 7,0) </td><td> 100 l </td></tr><tr><td> 0,5 M EDTA </td><td> 20 l </td></tr><tr><td colspan="2"> Agregue el agua a 9,95 ml en total. </td></tr><tr><td colspan="2"> Autoclave. </td></tr><tr><td colspan="2"> Añadir 50 l de 2-mercaptoetanol justo antes del uso. (5 l de 2-mercaptoetanol por 1 ml de solución desnaturalizante) Nota: Mantenga la solución de desnaturalización a 4 ° C. No utilice buffer más de una semana. Si es posible, una solución tampón fresca para su uso. </td></tr></table> ** Tampón de extracción 100 mM tampón fosfato de sodio [pH 7.0] 100 mM Tris-HCl [pH 7.0] 100 mM EDTA [pH 8.0] 1,5 M NaCl 1% hexadeciltrimetilamonio (CTAB) SDS al 2% <table border="0" style="font-size:9pt; width:400px;"><tr><td colspan="2"> Buffer de extracción de una L en el total de </td></tr><tr><td> De sodio 1M tampón fosfato [pH 7.0] * </td><td> 100 ml </td></tr><tr><td> 1M Tris-HCl [pH 7.0] </td><td> 100 ml </td></tr><tr><td> 0,5 M EDTA [pH 8.0] </td><td> 200 ml </td></tr><tr><td> 5 M NaCl </td><td> 300 ml </td></tr><tr><td colspan="2"> Autoclave y conservar a temperatura ambiente. </td></tr><tr><td colspan="2"> Añadir 200 ml, el bromuro de 5% hexadeciltrimetilamonio (CTAB, autoclave) y 100 ml, 20% SDS (autoclave), justo antes de su uso. Si CTAB se cristalizó, se derrite a 60 ° C. * 1M tampón fosfato de sodio: 57,7 ml, de sodio 1M fosfato monobásico (NaH 2 PO 4) y 42,3 ml, 1 M de fosfato sódico dibásico (NaH 2 PO 4). Ajustar el pH a 7.0 Nota: No use el 20% SDS si tiene la precipitación. Es normal ver suspensión lechosa cuando se agrega a la solución de SDS. Una vez que se agrega el desarrollo sostenible, colocar el tampón de extracción a 60 ° C para asegurar la SDS está bien suspendido. </td></tr></table>

extraction of high molecular weight genomic dna from soils and sediments

El microbioma del suelo es un reservorio inmenso y relativamente inexplorado de la diversidad genómica y la innovación metabólica que está íntimamente asociado a los nutrientes y el flujo de energía dentro de los ecosistemas terrestres. Cultivo independiente de genómica ambiental, también se conoce como metagenómica, enfoques promesa de un acceso sin precedentes a esta información genética con respecto a la reconstrucción de la vía y el cribado funcional de alto valor terapéutico y los procesos de conversión de biomasa. Sin embargo, el microbioma de la tierra sigue siendo un reto en gran parte debido a la dificultad en la obtención de ADN de alto peso molecular de una calidad suficiente para la producción de grandes bibliotecas de inserción. Aquí presentamos un protocolo para la extracción de alto peso molecular, el ADN genómico de la comunidad microbiana de los suelos y sedimentos. La calidad del ADN genómico aislado es ideal para la construcción de grandes bibliotecas de insertar genómica ambiental para las aplicaciones posteriores de secuenciación y detección. El procedimiento se inicia con la lisis celular. Paredes y membranas celulares de los microorganismos se lisan por fuerzas mecánicas (trituración) y químicos (β-mercaptoetanol). ADN genómico se aísla con tampón de extracción, el alcohol cloroformo-isoamílico y alcohol isopropílico. Los tampones utilizados para la lisis y etapas de extracción incluyen isotiocianato de guanidina y el bromuro de hexadeciltrimetilamonio (CTAB) para preservar la integridad de la alta molecular del ADN genómico de peso. Dependiendo de su aplicación posterior, el ADN genómico aislado puede ser purificado con cloruro de cesio (CsCl) ultracentrifugación gradiente, lo que reduce las impurezas tales como los ácidos húmicos. El primer procedimiento, la extracción, dura aproximadamente 8 horas, sin incluir la cuantificación de ADN paso. El gradiente de CsCl ultracentrifugación, es un proceso de dos días. Durante todo el procedimiento, el ADN genómico debe ser tratada con cuidado para evitar la esquila, evitar la agitación grave y dura pipeteo repetitivo.

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Extraction of High Molecular Weight Genomic DNA from Soils and Sediments

Una metodología para aislar de alto peso molecular y ADN genómico de alta calidad de la comunidad microbiana del suelo se describe.

La extracción de ADN de alta molecular genómico de peso de los suelos y los sedimentos

The soil microbiome is a vast and relatively unexplored reservoir of genomic diversity and metabolic innovation that is intimately associated with ...

Research

JoVE Journal

Biology

Isolation of Genomic DNA from Mouse Tails

El aislamiento de ADN genómico de colas de ratón

Investigación

Biología

DNA Extraction from 0.22 &mu;M Sterivex Filters and Cesium Chloride Density Gradient Centrifugation

DNA Extraction from 0.22 ÃƒÅ½Ã‚Â¼M Sterivex Filters and Cesium Chloride Density Gradient Centrifugation

Extracción de ADN de 0,22 M Filtros Sterivex y centrifugación de densidad de cloruro de cesio Gradient

This method is used to extract high molecular weight genomic DNA from planktonic biomass concentrated on 0.22 &mu;M Sterivex filters that have been ...

Using the GELFREE 8100 Fractionation System for Molecular Weight-Based Fractionation with Liquid Phase Recovery

Utilizando el sistema de fraccionamiento GELFREE 8100 de peso molecular basado en Fraccionamiento con la recuperación de la fase líquida

The GELFREE 8100 Fractionation System is a novel protein fractionation system designed to maximize protein recovery during molecular weight based ...

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Generación de ADN / ARN híbridos en el ADN genómico de transformación utilizando oligonucleótidos de ARN que contiene

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Un método práctico y novela para extraer el ADN genómico de los kits de extracción de sangre para la Preservación Plasma Protein

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Retroviruses exhibit signature integration preferences on both the local and global scales. Here, we present a detailed protocol for (1) generation of ...