Name: elime (enzyme linked immuno magnetic electrochemical) method for mycotoxin detection
Uploaded: 2009-10-23T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about ELIME Enzyme Linked Immuno Magnetic Electrochemical Method for Mycotoxin Detection at JoVE.com

המחברים מבקשים להודות ננסי דאונר וכל חברי מהמעבדה של כימיה אנליטית, אוניברסיטת רומא &quot;טור Vergata&quot; על שיתוף הפעולה שלהם ותמיכה לוגיסטית. עבודה זו נתמכה על ידי האיחוד האירופי את הפרויקט &quot;BioCop&quot;.

1) חסימה חרוזים מגנטיים מצופה: המשך כמו בצע לחסום חרוזים מגנטי מצופה: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן מערכת של 2 צינורות מ&quot;ל Eppendorf; </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Homogenize (רועד אך לא vortexing) חרוזים מגנטיים מצופה (ראה נ?...

<ol>
	<li>Koch, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=State+of+the+art+of+trichothecenes+analysis.">State of the art of trichothecenes analysis.</a> Toxicol. Letters. 153, 109-112 (2004).</li><li>Krska, R., Baumgartner, S., Josephs, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=State+of+the+art+in+the+analysis+of+type-A+and-B+trichothecene+mycotoxins+in+cereals.">State of the art in the analysis of type-A and-B trichothecene mycotoxins in cereals.</a> Fresenius J. Anal. Chem. 371, 285-299 (2001).</li><li>Morozova, T. Y., Morozov, V. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Force+differentiation+in+recognition+of+cross-reactive+antigens+by+magnetic+beads.">Force differentiation in recognition of cross-reactive antigens by magnetic beads.</a> Anal. Biochem. , 263-271 (2008).</li><li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FAO+Food+and+Nutrition+Paper+74.">FAO Food and Nutrition Paper 74.</a> JOINT FAO/WHO EXPERT COMMITTEE ON FOOD ADDITIVES Fifty-sixth meeting. , 115 (2001).</li><li>Piermarini, S., Volpe, G., Ricci, F., Micheli, L., Moscone, D., Palleschi, G., Fuhrer, M., Krska, R., Baumgartner, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+Screening+Electrochemical+Methods+for+Aflatoxin+B1+and+Type-A+Trichothecenes:+a+preliminary+study.">Rapid Screening Electrochemical Methods for Aflatoxin B1 and Type-A Trichothecenes: a preliminary study.</a> Anal. Lett. 40, 1333-1346 (2007).</li><li>Findlay, J. W. A., Dillard, R. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Appropriate+calibration+curve+fitting+in+ligand+binding+assays.">Appropriate calibration curve fitting in ligand binding assays.</a> AAPS J. 9 (2), E260-E267 (2007).</li><li>Ricci, F., Volpe, G., Micheli, l., Palleschi, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+review+on+novel+developments+and+applications+of+immunosensors+in+food+analysis.">A review on novel developments and applications of immunosensors in food analysis.</a> Anal. Chim. Acta. 605 (2), 111-129 (2007).</li></ol>

השימוש נוגדנים כמו בדיקה הכרה biomolecular ראה השימוש הנרחב בטכנולוגיות חישה; מתודולוגיות גילוי immunochemical, כגון ELISAs ו MEIAs, נמצאים, כיום, בין פלטפורמות השתמשו ביותר מיושם במעבדות רבות 7. בעוד הגישות הללו להשיג רגישות וספציפיות חריגי?...

ריאגנטים <table border="1" cellspacing="0" cellpadding="0" style=";text-align:right;direction:rtl"><tr><td> שם מגיב </td><td> חברה </td><td> מספר קטלוגי </td><td> הערות (אופציונלי) </td></tr><tr><td> אשלגן כלורי </td><td> סיגמא </td><td> P9333 </td><td></td></tr><tr><td> אשלגן זרחתי dihydrogen </td><td> סיגמא </td><td> P9791 </td><td></td></tr><tr><td> Disodium פוספט מימן </td><td> סיגמא </td><td> S3264 </td><td></td></tr><tr><td> נתרן כלורי </td><td> סיגמא </td><td> S3014 </td><td></td></tr><tr><td> MgCl 2 anhydrous </td><td> סיגמא </td><td> M8266 </td><td></td></tr><tr><td> ה-DEA (99.5%) </td><td> סיגמא </td><td> 31589 </td><td></td></tr><tr><td> HCl 37% </td><td> סיגמא </td><td> 320331 </td><td></td></tr><tr><td> H 3 BO 3 </td><td> סיגמא </td><td> B6768 </td><td></td></tr><tr><td> טריס [hydroxymethyl]-aminomethane </td><td> סיגמא </td><td> 252859 </td><td></td></tr><tr><td> ארגון ה-BSA (אלבומין בסרום שור) </td><td> סיגמא </td><td> A4503 </td><td></td></tr><tr><td> NaOH </td><td> סיגמא </td><td> S5881 </td><td></td></tr><tr><td> Tween 20 </td><td> סיגמא </td><td> P9416 </td><td></td></tr><tr><td> 3 NaN </td><td> אלדריץ&#39; </td><td> 71290 </td><td></td></tr><tr><td> 1-Naphthyl disodium מלח פוספט </td><td> Fluka </td><td> N7255 </td><td></td></tr><tr><td> חלב פתרון ריפרף חסימת - ללא חלב יבש שומן </td><td> Bio-Rad </td><td> 170-6404 </td><td></td></tr><tr><td> HT-2 מצומדות עם KLH (Hemocyanin Keyhole צלחית), פתרון מניות (1 מ&quot;ג / מ&quot;ל ​​PBS): </td><td> Biopure </td><td> 004050 </td><td> HT-2-KLH המצומד הושג על ידי שיטת-CDI שם חופשי OH-לקבוצות על המיקום 3 ו -4 על רעלן HT-2 היו מופעלים על ידי N, N&#39;-carbonyldiimidazole (CDI) ואת הפעלת HT-2 היה רעלן בואו להגיב aminogroups של החלבון (KLH) כדי ליצור הצמדה carbammate יציב. </td></tr><tr><td> נוגדן הנקרא משניים: אנטי עכבר IgG (H + L) מסוס, מצומדות עם phosphatase אלקליין, בריכוז 1 מ&quot;ג / מ&quot;ל. </td><td> וקטור מעבדות </td><td> AP-2000 </td><td></td></tr><tr><td> HT-2 רעלן </td><td> Biopure </td><td></td><td></td></tr><tr><td> חרוזים מגנטיים: Dynabeads ® </td><td> Dynal </td><td> M-280 Tosylactivated </td><td> ריכוז 2 x 10 9 חרוזים / ml. </td></tr></table> פתרונות <table border="1" cellspacing="0" cellpadding="0" style=";text-align:right;direction:rtl"><tr><td> שם מגיב </td><td> הכנה </td><td> הערות (אופציונלי) </td></tr><tr><td> שנאגרו מלוחים פוספט (PBS), pH 7.4 </td><td> להמיס 0.20 גרם של אשלגן כלורי, 0.20 גרם של אשלגן dihydrogen פוספט, 1.16 גרם של מימן disodium פוספט ו 8.00 גרם של נתרן כלורי ב 900 מ&quot;ל מים </td><td></td></tr><tr><td> Diethanolamine חיץ, DEA, 0.97 מ &#39;+ 1 mM MgCl 2 + 0.15 M KCl, pH 9.8 </td><td> ממיסים 0.0476g של MgCl 2 anhydrous ו 7.3.59 גרם של KCl ב ~ 300 מ&quot;ל מים. לאחר פירוק להוסיף 51 מ&quot;ל של ה-DEA (99.5%). התאם ל-pH 9.8 עם HCl (6 ז). מדולל 500 מ&quot;ל מים. </td><td></td></tr><tr><td> חיץ borate, 0.1 מ &#39;, pH 9.5 </td><td> להמיס 3.09 גרם של H 3 BO 3 ב ~ 300 מ&quot;ל של מים מזוקקים, כדי להתאים את pH 9.5 עם NaOH ו / או HCl (6 M או בריכוזים נמוכים). מדולל 500 מ&quot;ל עם מים מזוקקים. </td><td></td></tr><tr><td> טריס חיץ, 0.2 מ &#39;, pH 8.5 </td><td> להמיס 3.85 גרם של טריס [hydroxymethyl]-aminomethane ב 100 מ&quot;ל מים. התאם ל-pH 8.5 עם NaOH ו / או HCl (6 M או בריכוזים נמוכים). מדולל ל 200 מ&quot;ל מים. </td><td></td></tr><tr><td> טריס חיץ + BSA פתרון (0.1%), pH 8.4 </td><td> ממיסים 0.050 גרם של BSA ב 50 מ&quot;ל של חיץ טריס pH 8.4. </td><td> פתרון זה חייב להיות מוכן טרי ביום השימוש. </td></tr><tr><td> PBS חיץ + tween ® 0.05% </td><td> ממיסים 0.250 גרם tween 20 ב 500 מ&quot;ל של הכינו בעבר PBS חיץ, pH 7.4 </td><td></td></tr><tr><td> PBS חיץ + BSA פתרון 0.1% </td><td> ממיסים 0.050 גרם של BSA ב 50 מ&quot;ל של PBS חיץ, pH 7.3. </td><td> פתרון זה חייב להיות מוכן טרי ביום השימוש. </td></tr><tr><td> PBS חיץ BSA + 0.1% + NaN 3 0.02% </td><td> ממיסים 0.050 גרם ו - 0.010 BSA של NaN 3 ב 50 מ&quot;ל של PBS חיץ, pH 7.3. </td><td> אחסון סולution </td></tr><tr><td> אנזימתי המצע </td><td> ממיסים 0.010 גרם של מלח 1-Naphthyl סודיום פוספט ב 100 מ&quot;ל של pH חיץ DEA 9.8. לעטוף את הבקבוק היטב בנייר אלומיניום. </td><td> פתרון זה חייב להיות מוכן טרי ביום השימוש. </td></tr><tr><td> חלב פתרון ריפרף חסימת </td><td> הוסף 0.20 גר &#39;של סופג חוסם כיתה ללא שומן חלב יבש (Bio-Rad, הרקולס, קליפורניה, ארה&quot;ב) עד 200 מ&quot;ל של PBS חיץ pH 7.3. </td><td> פתרון זה חייב להיות מוכן טרי ביום השימוש. </td></tr><tr><td> HT-2 מניות פתרון </td><td> להמיס 10 מ&quot;ג של הבקבוקון trichothecene HT-2 רעלן, ב 10 מ&quot;ל של אצטוניטריל לתת פתרון עם ריכוז של 1 מ&quot;ג / מ&quot;ל. </td><td> פצל את הפתרון הזה לתוך לשימוש יחיד aliquots של 30 מ&quot;ל ולאחסן אותם בפחות מ -30 ° C. </td></tr><tr><td> HT-2 עבודה פתרון סטנדרטי </td><td> פיפטה 20 מ&quot;ל של תמיסת HT-2 מניות רעלן לתוך מ&quot;ל 2 מכויל בקבוק volumetric ו לדלל עם אצטוניטריל להשיג פתרון HT-2 עבודה המכיל 10 מיקרוגרם / מ&quot;ל ​​של רעלן trichothecene. </td><td> פתרון זה אמור להיות מוכן טרי ביום השימוש. </td></tr><tr><td> HT-2 calibrant פתרונות עבודה </td><td> לדלל את הפתרון HT-2 תקן עובדים (10 מיקרוגרם / מ&quot;ל) להכין פתרון calibrant עובד 100 ng / ml. מדולל HT-2 עובדים פתרון calibrant 100 ng / ml להכין עבודה פתרונות calibrant הריכוזים הבאים 0 (ריק), 0.5, 1, 2, 4, 10 ng / ml. </td><td> פתרונות אלה צריכים להיות מוכנים טריים ביום השימוש. </td></tr><tr><td> HT-2 מצומדות עם KLH </td><td> פצל את HT-2 מצומדות עם פתרון (Hemocyanin Keyhole צלחית) מניות KLH (1 מ&quot;ג / מ&quot;ל ​​PBS) לתוך לשימוש יחיד aliquots של μl 350. </td><td> חנות aliquots ב -30 ° C. </td></tr><tr><td> נוגדן חד שבטי ספציפי </td><td> מדולל 1:350 (v: v) את ריכוז מניות (1.383 מ&quot;ג / מ&quot;ל) של נוגדנים חד שבטיים ב PBS להשתמש בשלב התחרות </td><td> פתרון זה חייב להיות מוכן טרי ברגע השימוש. 10 מניות מ&quot;ל נוגדן פתרון PBS עבור נפח סופי של 3.5 מ&quot;ל, הם מספיק כדי לנתח 17 תקנים ו / או דוגמאות. </td></tr><tr><td> נוגדן תווית משני </td><td> אנטי עכבר IgG (H + L) מצומדות עם phosphatase אלקליין הוא מדולל 1:100 (v: v) ב-PBS להשתמש בשלב התחרות. </td><td> 100 μl נוגדן מניות פתרון PBS עבור נפח סופי של 10 מ&quot;ל, הם מספיק כדי לנתח 25 תקנים ו / או דוגמאות. פתרון זה חייב להיות מוכן טרי ברגע השימוש. </td></tr></table> מנגנון <table border="1" cellspacing="0" cellpadding="0" style=";text-align:right;direction:rtl"><tr><td> שם מגיב </td><td> חברה </td><td> הערות (אופציונלי) </td></tr><tr><td> חלקיקים מגנטיים מרוכז: MPC ®-S </td><td> Dynal </td><td></td></tr><tr><td> PalmSens מכשיר </td><td> PalmSens </td><td> מסופק עם PalmSens לייט, כבל חיבור טורי מחשב נייד ו Mux תוכנה אפשרויות </td></tr><tr><td> CH8 PalmSens מרבב </td><td> PalmSens </td><td></td></tr><tr><td> שמונה Mux ערוץ מגע חשמלי </td><td> עבודת יד </td><td></td></tr><tr><td> רצועת עם שמונה אלקטרודות מסך מודפסים (SPES) </td><td> עבודת יד </td><td></td></tr><tr><td> תמיכה תוכנן במיוחד עבור רצועת אלקטרודות </td><td> עבודת יד </td><td> כולל 8 מגנטים ניאודימיום שכל אחד מהם ממוקם מתחת לפני השטח כל אלקטרודה העבודה של SPE </td></tr><tr><td> Microliter pipettes מכויל </td><td> Gilson </td><td></td></tr><tr><td> Stirrer מגנטי וברים ומערבבים. </td><td></td><td></td></tr><tr><td> זכוכית כוסות (100, 50, 20 מ&quot;ל). </td><td></td><td></td></tr><tr><td> נפחית צלוחיות (2ml). </td><td></td><td></td></tr><tr><td> 0.2 ו 2ml Eppendorf צינורות. </td><td> Eppendorf </td><td></td></tr><tr><td> פלקון ™ שפופרות של 5 מ&quot;ל ו - 15 מ&quot;ל. </td><td> בז </td><td></td></tr><tr><td> מעבדה וורטקס מערבל </td><td></td><td> אין להשתמש במיקסר מערבולת כדי resuspend חרוזים מגנטיים מצופה HT2-KLH או מקושרים עם שרשרת החיסונית כדי למנוע denaturing חלקים proteic </td></tr><tr><td> מעבדה תנור או חדר thermostated </td><td></td><td> בחרו תנור מסוגלים לשמור על טמפרטורה של 37 ± 3 ° C. </td></tr></table>

elime (enzyme linked immuno magnetic electrochemical) method for mycotoxin detection

Immunoassays הם אלטרנטיבה חוקית ועד יקר יותר זמן רב כמותי HPLC או GC 1, 2 שיטות לאיתור הקרנת mycotoxins מסוכנים מצרכי מזון. בפרוטוקול זה אנו מראים כיצד לפברק ולחקור אנזים אלקטרוכימיים תחרותי assay immunomagnetic המקושרים המבוססים על שימוש של חרוזים מגנטיים תמיכה מוצקה עבור שרשרת immunochemical 3 ואלקטרודות מסך מודפס חישה פלטפורמה. השיטה שלנו שואפת לקבוע את הסכום הכולל של HT-2 ו-T-2 רעלים, mycotoxins השייכת למשפחת trichothecenes ושל דאגה רבה לבריאות האדם 4. השימוש שיבוט נוגדן עם תגובתיות צלב של 100% כלפי HT-2 ו-T-2 מאפשרת לזהות בו זמנית הן רעלים עם רגישות דומה 5. הצעד הראשון של assay שלנו היא הצעד ציפוי שבו אנו לשתק HT2-KLH רעלן המצומד על פני השטח של חרוזים מגנטיים. אחרי צעד חסימה, הכרחי כדי למנוע אי - קליטה ספציפיות, תוספת של נוגדנים חד שבטיים מאפשר תחרות בין משותקת HT-2 ו חינם HT-2 או T-2 להציג במדגם או מומס בתמיסה סטנדרטית. בסוף שלב התחרות, כמות נוגדנים חד שבטיים קשור משותקת HT-2 יהיה ביחס הפוך לכמות רעלן בפתרון המדגם. נוגדנים משני שכותרתו עם phosphatase אלקליין (AP) משמש כדי לחשוף את מחייב בין הנוגדן הספציפי משותקת HT-2. צעד המדידה הסופית מתבצעת על ידי הטלת aliquot ההשעיה חרוז מגנטי, המתאים פתרון מדגם מסוים / רגיל, על פני השטח של האלקטרודה המסך המודפס עבודה; חרוזים מגנטיים הם משותקים ומרוכז באמצעות מגנט ממוקם בדיוק מתחת מסך מודפס אלקטרודה. אחרי שתי דקות של דגירה בין חרוזים מגנטיים מצע עבור AP, המוצר האנזימטית הוא זוהה על ידי Voltammetry דיפרנציאלי Pulse (DPV) באמצעות מכשיר נייד (PalmSens) יכול גם ליזום באופן אוטומטי eight מדידות תוך הפסקה של כמה שניות.

Watch this Scientific Journal Video about ELIME Enzyme Linked Immuno Magnetic Electrochemical Method for Mycotoxin Detection at JoVE.com

ELIME Enzyme Linked Immuno Magnetic Electrochemical Method for Mycotoxin Detection

פרוטוקול לזהות trichothecenes (mycotoxins של דאגה לבריאות האדם) בשיטת ההקרנה החדשה שפותחה על בסיס שיטת immunochemical תחרותי זיהוי סופי אלקטרוכימיים מודגם.

ELIME (אנזימים מקושרים חיסונית מגנטי אלקטרוכימי) שיטת איתור Mycotoxin

Immunoassays are a valid alternative to the more expensive and time consuming quantitative HPLC or GC1, 2 methods for the screening detection of hazardous ...

Research

JoVE Journal

Biology

ELIME (Enzyme Linked Immuno Magnetic Electrochemical) Method for Mycotoxin Detection

Detection of Protein Ubiquitination

זיהוי של חלבון Ubiquitination

Ubiquitination, the covalent attachment of the polypeptide ubiquitin to target proteins, is a key posttranslational modification carried out by a set of ...

Isolation of Labile Multi-protein Complexes by in vivo Controlled Cellular Cross-Linking and Immuno-magnetic Affinity Chromatography

Isolation of Labile Multi-protein Complexes by in vivo Controlled Cellular Cross-Linking and Immuno-magnetic Affinity Chromatography

בידוד יציב Multi-חלבון על ידי תסביכים In vivo מבוקר נייד חוצה קישור חיסונית מגנטי כרומטוגרפיה זיקה

The dynamic nature of cellular machineries is frequently built on transient and/or weak protein associations. These low affinity interactions preclude ...

Pulse-chase Analysis of N-linked Sugar Chains from Glycoproteins in Mammalian Cells

Pulse-מרדף ניתוח של N-linked שרשראות סוכר מ גליקופרוטאינים בתאי יונקים

Attachment of the Glc3Man9GlcNAc2 precursor oligosaccharide to nascent polypeptides in the ER is a common modification for secretory proteins. Although ...

Rapid Homogeneous Detection of Biological Assays Using Magnetic Modulation Biosensing System

איתור מהיר של מבחני אחידים ביולוגית באמצעות מערכת מגנטית biosensing אפנון

A magnetic modulation biosensing system (MMB) [1,2] rapidly and homogeneously detected biological targets at low concentrations without any washing or ...

Direct Detection of the Acetate-forming Activity  of the Enzyme Acetate Kinase

זיהוי ישיר של פעילות Acetate יוצרי של קינאז Acetate אנזימים

Acetate kinase, a member of the acetate and sugar kinase-Hsp70-actin (ASKHA) enzyme superfamily1-5, is responsible for the reversible phosphorylation of ...

Electroantennographic Bioassay as a Screening Tool for Host Plant Volatiles

המבדק Electroantennographic ככלי מיון עבור נדיפים צמחים מארח

Plant volatiles play an important role in plant-insect interactions. Herbivorous insects use plant volatiles, known as kairomones, to locate their host ...

qPCR Is a Sensitive and Rapid Method for Detection of Cytomegaloviral DNA in Formalin-fixed, Paraffin-embedded Biopsy Tissue

qPCR הוא שיטה רגישה ומהירה לאיתור של Cytomegaloviral DNA בקבועה פורמלין, רקמות ביופסיה מוטבעות פרפין

It is crucial to identify cytomegalovirus (CMV) infection in the gastrointestinal (GI) tract of immunosuppressed patients, given their greater risk for ...

Multi-enzyme Screening Using a High-throughput Genetic Enzyme Screening System

הקרנה רב-אנזים באמצעות מערכת הקרנת אנזים הגנטי תפוקה גבוהה

The recent development of a high-throughput single-cell assay technique enables the screening of novel enzymes based on functional activities from a ...

Nuclei Isolation from Whole Tissue using a Detergent and Enzyme-Free Method

גרעיני בידוד מרקמות שלמות באמצעות ניקוי ושיטה נטולת אנזימים

High-throughput transcriptome and epigenome profiling requires preparation of a single cell or single nuclei suspension. Preparation of the suspension ...

Detection of Plasmodium Sporozoites in Anopheles Mosquitoes using an Enzyme-linked Immunosorbent Assay

Detection of Plasmodium Sporozoites in Anopheles Mosquitoes using an Enzyme-linked Immunosorbent Assay

איתור פלסמודיום ספורוזואיטים ביתושי אנופלס באמצעות בדיקת אימונוסורבנט מקושרת אנזים

Plasmodium sporozoites are the infective stage of malaria parasites that infect humans. The sporozoites residing in the salivary glands of female ...