Name: elime (enzyme linked immuno magnetic electrochemical) method for mycotoxin detection
Uploaded: 2009-10-23T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about ELIME Enzyme Linked Immuno Magnetic Electrochemical Method for Mycotoxin Detection at JoVE.com

著者は、彼らのコラボレーションと後方支援のために分析化学、ローマ大学&quot;トルヴェルガータ&quot;の研究室からナンシーダウナーとすべてのメンバーに感謝したいと思います。この作品は、EUのプロジェクト&quot;BioCop&quot;によってサポートされていました。

1）被覆磁気ビーズをブロッキング： 被覆磁気ビーズをブロックするために以下のように進んでください： <ol><li> 2ミリリットルエッペンドルフチュー​​ブのセットを準備します。 </li><li> （揺れがボルテックスではない）ミキサーを回転させるサンプルを用いてコーティングされた磁気ビーズを（被覆磁性ビーズの調製のための付録を参照）ホモジナイズ。 </li><li>す?...

<ol>
	<li>Koch, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=State+of+the+art+of+trichothecenes+analysis.">State of the art of trichothecenes analysis.</a> Toxicol. Letters. 153, 109-112 (2004).</li><li>Krska, R., Baumgartner, S., Josephs, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=State+of+the+art+in+the+analysis+of+type-A+and-B+trichothecene+mycotoxins+in+cereals.">State of the art in the analysis of type-A and-B trichothecene mycotoxins in cereals.</a> Fresenius J. Anal. Chem. 371, 285-299 (2001).</li><li>Morozova, T. Y., Morozov, V. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Force+differentiation+in+recognition+of+cross-reactive+antigens+by+magnetic+beads.">Force differentiation in recognition of cross-reactive antigens by magnetic beads.</a> Anal. Biochem. , 263-271 (2008).</li><li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FAO+Food+and+Nutrition+Paper+74.">FAO Food and Nutrition Paper 74.</a> JOINT FAO/WHO EXPERT COMMITTEE ON FOOD ADDITIVES Fifty-sixth meeting. , 115 (2001).</li><li>Piermarini, S., Volpe, G., Ricci, F., Micheli, L., Moscone, D., Palleschi, G., Fuhrer, M., Krska, R., Baumgartner, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+Screening+Electrochemical+Methods+for+Aflatoxin+B1+and+Type-A+Trichothecenes:+a+preliminary+study.">Rapid Screening Electrochemical Methods for Aflatoxin B1 and Type-A Trichothecenes: a preliminary study.</a> Anal. Lett. 40, 1333-1346 (2007).</li><li>Findlay, J. W. A., Dillard, R. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Appropriate+calibration+curve+fitting+in+ligand+binding+assays.">Appropriate calibration curve fitting in ligand binding assays.</a> AAPS J. 9 (2), E260-E267 (2007).</li><li>Ricci, F., Volpe, G., Micheli, l., Palleschi, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+review+on+novel+developments+and+applications+of+immunosensors+in+food+analysis.">A review on novel developments and applications of immunosensors in food analysis.</a> Anal. Chim. Acta. 605 (2), 111-129 (2007).</li></ol>

生体分子認識プローブとしての抗体の使用は、センシング技術の普及を見ている、そのようなELISAおよびMEIAsなどの免疫化学的検出手法は、多くの研究室7で最も使用されると適用されるプラットフォームの間で、今日では、です。 これらのアプローチは、優れた感度と特異性を達成しながら、過去数年間で多くの研究グループの主な目的は、彼らのパフォーマン?...

試薬<table border="1" cellspacing="0" cellpadding="0"><tr><td> 試薬の名前 </td><td> 会社 </td><td> カタログ番号 </td><td> コメント（省略可能） </td></tr><tr><td>カリウム塩化</td><td>シグマ</td><td> P9333 </td><td></td></tr><tr><td>カリウムリン酸二水素</td><td>シグマ</td><td> P9791 </td><td></td></tr><tr><td>リン酸水素二ナトリウム</td><td>シグマ</td><td> S3264 </td><td></td></tr><tr><td>ナトリウム塩化</td><td>シグマ</td><td> S3014 </td><td></td></tr><tr><td> MgCl 2の無水</td><td>シグマ</td><td> M8266 </td><td></td></tr><tr><td> DEA（99.5％） </td><td>シグマ</td><td> 31589 </td><td></td></tr><tr><td>塩酸37パーセント</td><td>シグマ</td><td> 320331 </td><td></td></tr><tr><td> H 3 BO 3 </td><td>シグマ</td><td> B6768 </td><td></td></tr><tr><td>トリス[ヒドロキシメチル]アミノメタン</td><td>シグマ</td><td> 252859 </td><td></td></tr><tr><td> BSA（ウシ血清アルブミン） </td><td>シグマ</td><td> A4503 </td><td></td></tr><tr><td> NaOHで</td><td>シグマ</td><td> S5881 </td><td></td></tr><tr><td> Tween 20 </td><td>シグマ</td><td> P9416 </td><td></td></tr><tr><td> NaN 3を </td><td>アルドリッチ</td><td> 71290 </td><td></td></tr><tr><td> 1 - ナフチルりん酸二ナトリウム塩</td><td>フルカ</td><td> N7255 </td><td></td></tr><tr><td>スキムミルクをブロッキング溶液 - 非脂肪ドライミルク</td><td> Bio - Rad社</td><td> 170-6404 </td><td></td></tr><tr><td> ：KLH（キーホールリンペットヘモシアニン）、ストック溶液（PBS中の1 mg / ml）を持つHT - 2共役</td><td>ピュア</td><td> 004050 </td><td> HT - 2 - KLH複合体は、HT - 2トキシンでの位置3と4の遊離OH基がN、N&#39; -カルボニルジイミダゾール（CDI）と活性化HT - 2毒素WASによってアクティブ化されたCDI法によって得られた安定したcarbammateリンケージを生成するタンパク質（KLH）のアミノ基と反応することができます。 </td></tr><tr><td>二次標識抗体：馬から抗マウスIgG（H + L）、アルカリ性ホスファターゼと結合した、濃度1 mg / mlの。 </td><td>ベクターラボラトリーズ</td><td> AP - 2000 </td><td></td></tr><tr><td> HT - 2トキシン</td><td>ピュア</td><td></td><td></td></tr><tr><td>磁気ビーズ：Dynabeads ®は</td><td> DYNAL </td><td> M - 280 Tosylactivated </td><td>濃度2 × 10 9ビーズ/ mlの。 </td></tr></table>ソリューション<table border="1" cellspacing="0" cellpadding="0"><tr><td> 試薬の名前 </td><td> 準備 </td><td> コメント（省略可能） </td></tr><tr><td>リン酸緩衝生理食塩水（PBS）、pH7.4の緩衝化</td><td>水900 mlに塩化カリウム0.20gの、リン酸二水素カリウム0.20gの、リン酸水素二ナトリウムの1.16 gおよび塩化ナトリウムの8.00グラムを溶かす</td><td></td></tr><tr><td>ジエタノールアミンバッファー、DEA、0.97 M + 1mMのMgCl 2 + 0.15 MのKCl、pHは9.8 </td><td>水の〜300mlの塩化マグネシウム無水およびKClの7.3.59 gの0.0476グラム溶かす。解散後はDEAの51ミリリットル（99.5％）を追加します。塩酸（6M）で9.8にpHを調整する。水で500 mlに希釈する。 </td><td></td></tr><tr><td>ホウ酸緩衝液、0.1 M、pH9.5の</td><td>蒸留水の約300 mlのH 3 BO 3の3.09グラムを溶かし、NaOHおよび/ ​​または塩酸（6 Mまたはより低い濃度）で9.5にpHを調整する。蒸留水で500 mlに希釈する。 </td><td></td></tr><tr><td>トリス緩衝液、0.2 M、pH 8.5の</td><td>水100ml中のトリス[ヒドロキシメチル]アミノメタンの3.85グラムを溶かす。 NaOHおよび/または塩酸（6 Mまたはより低い濃度）でpH8.5に調整してください。水で200mlに希釈する。 </td><td></td></tr><tr><td> TRIS緩衝+ BSA溶液（0.1％）、pHは8.4 </td><td>トリス緩衝液pH 8.4の50ml中にBSAの0.050グラムを溶かす。 </td><td>このソリューションは、新鮮な使用の当日に準備する必要があります。 </td></tr><tr><td> PBSバッファー+ TWEEN ® 0.05パーセント</td><td>事前に準備したPBS緩衝液（pH7.4）500mlにTween 20の0.250グラムを溶かす</td><td></td></tr><tr><td> PBSバッファー+ BSA液0.1％ </td><td> PBS緩衝液、pH7.3に50mlのBSAの0.050グラムを溶かす。 </td><td>このソリューションは、新鮮な使用の当日に準備する必要があります。 </td></tr><tr><td> PBS緩衝液+ 0.1％BSA + NaN 3を 0.02パーセント</td><td> PBS緩衝液、pH7.3に50ml中のNaN 3のBSAおよび0.010 0.050グラムを溶かす。 </td><td>ストレージゾルution </td></tr><tr><td>酵素基質</td><td> DEA緩衝液pH 9.8 100 mlの1 - ナフチルりん酸ナトリウム塩0.010 gを溶かす。アルミホイルでしっかりとフラスコを巻きます。 </td><td>このソリューションは、新鮮な使用の当日に準備する必要があります。 </td></tr><tr><td>スキムミルクブロッキング溶液</td><td> PBS緩衝液、pH7.3の200mlにグレードブロ​​ッカー脱脂粉乳（Bio - Rad社、ヘラクレス、CA、米国）をブロッティング0.20gのを追加。 </td><td>このソリューションは、新鮮な使用の当日に準備する必要があります。 </td></tr><tr><td> HT - 2ストック溶液</td><td>をアセトニトリル10mlに、トリコテセンHT - 2毒素のバイアル10 mgを溶かし 1 mg / mlの濃度の溶液。 </td><td> 30mlの単回使用アリコートにこのソリューションを分割し、-30℃未満で保管します</td></tr><tr><td> HT - 2は、標準溶液の作業</td><td>ピペット2ミリリットル校正されたメスフラスコにHT - 2トキシンのストック溶液20ml及びトリコテセン毒素の10μg/ mlを含むHT - 2ワーキング溶液を調製するためにアセトニトリルで希釈する。 </td><td>このソリューションは、新鮮な使用の当日に準備する必要があります。 </td></tr><tr><td>較正ソリューションワーキングHT - 2 </td><td>ワーキング較正液100 ng / mlに調製するためにHT - 2作業標準溶液（10μg/ ml）を希釈する。下記の濃度0（ブランク）、0.5、1、2、4、10 ng / mlの較正ソリューションを作業準備するHT - 2営業較正液100 ng / mlに希釈する。 </td><td>これらのソリューションは、使用当日に新しく調製する必要があります。 </td></tr><tr><td> KLHとHT - 2共役</td><td> 350μlのの単回使用アリコートにKLH（キーホールリンペットヘモシアニン）ストック溶液（PBSで1 mg / ml）でHT - 2共役分割。 </td><td> -30℃で保存のアリコート</td></tr><tr><td>特異的モノクローナル抗体</td><td>競争のステップで使用するPBS中のモノクローナル抗体のストック濃度（1.383 mg / ml）を：1:350（V V）を希釈する</td><td>この溶液は使用時の瞬間に新しく調製する必要があります。 3.5ミリリットルの最終体積のPBSで10 mlの抗体ストック溶液は、17の規格及び/またはサンプルを分析するのに十分です。 </td></tr><tr><td>二次標識抗体</td><td> PBSでの競争のステップで使用する：アルカリフォスファターゼで標識抗マウスIgG（H + L）を1:100（V V）が希釈される。 </td><td> 10mlの最終容量のPBSで100μlの抗体ストック溶液は、25の規格及び/またはサンプルを分析するのに十分です。この溶液は使用時の瞬間に新しく調製する必要があります。 </td></tr></table>装置<table border="1" cellspacing="0" cellpadding="0"><tr><td> 試薬の名前 </td><td> 会社 </td><td> コメント（省略可能） </td></tr><tr><td>磁性粒子コンセントレータ：MPC ® - S </td><td> DYNAL </td><td></td></tr><tr><td> PalmSensの楽器</td><td> PalmSens </td><td> PalmSens Liteは、シリアルケーブル接続しているPCのラップトップおよびマルチプレクサのオプションのソフトウェアで提供</td></tr><tr><td> CH8 PalmSensマルチプレクサ</td><td> PalmSens </td><td></td></tr><tr><td> 8チャンネルマルチプレクサの電気的接触</td><td>ハンドメイド</td><td></td></tr><tr><td> eightスクリーン印刷電極（SPEは）とストリップ</td><td>ハンドメイド</td><td></td></tr><tr><td>電極ストリップのために特別に設計サポート</td><td>ハンドメイド</td><td> SPEの各作用電極表面の下に配置され、それぞれが8ネオジウム磁石が含まれています</td></tr><tr><td>校正済みマイクロタイターピペット</td><td>ギルソン</td><td></td></tr><tr><td>マグネチックスターラーとスターラーバー。 </td><td></td><td></td></tr><tr><td>ガラスビーカー（100、50、20ml）に。 </td><td></td><td></td></tr><tr><td>メスフラスコ（2ミリリットル）。 </td><td></td><td></td></tr><tr><td> 0.2〜2ミリリットルエッペンドルフチュー​​ブ。 </td><td>エッペンドルフ</td><td></td></tr><tr><td> 5ミリリットルと15ミリリットルのファルコン™チューブ。 </td><td>ファルコン</td><td></td></tr><tr><td>実験室ボルテックスミキサー</td><td></td><td> proteic部品の変性を避けるために免疫学的なチェーンでHT2 - KLHでコーティングされたまたはリンクされた磁気ビーズを再懸濁するためにボルテックスミキサーを使用しないでください。 </td></tr><tr><td>実験室のオーブンやサーモスタット部屋</td><td></td><td>温度37 ± 3℃を維持することができるオーブンを選ぶ</td></tr></table>

elime (enzyme linked immuno magnetic electrochemical) method for mycotoxin detection

イムノアッセイは、より高価で時間のかかる定量的なHPLCやGC 1、食料品の危険なマイコトキシンのスクリーニング検出のための2つの方法への有効な代替手段です。このプロトコルでは、プラットフォームを感知するなど、免疫化学チェーン3とスクリーン印刷電極の固体支持体として磁性ビーズの使用に基づいて、リンクされた免疫アッセイを作製し、電気化学的競争力のある酵素を尋問する方法を示します。 提案手法では、HT - 2とT - 2毒素の総量、トリコテセンの家族と人間の健康4の大きな懸念の属するマイコトキシンを決定することを目的とする。 HT - 2とT - 2に向かって100％の交差反応性抗体のクローンの使用は、同時に同じような感度5で両方の毒素を検出することができます。 私たちの分析の最初のステップは、我々は磁気ビーズの表面にHT2 - KLH複合体の毒素を固定化コーティングのステップです。非固有の吸収を避けるために必要なブロッキングのステップ、後に、モノクローナル抗体の添加は、HT - 2とフリーHT - 2やT - 2試料中に存在するか、標準液に溶解固定化との間の競争が可能になります。 競争のステップの終了時に、固定化HT - 2にリンクされているモノクローナル抗体の量は、試料溶液中の毒素の量に反比例します。 アルカリホスファターゼ（AP）で標識二次抗体を特異的抗体と固定化HT - 2の間の結合を明らかにするために使用されます。最後の測定ステップは、スクリーン印刷された作用電極の表面に、特定のサンプル/標準溶液に対応する磁気ビーズ懸濁液のアリコートを、ドロップすることによって実行されます。磁気ビーズは、下に正確に配置磁石により固定化し、そして濃縮されていますスクリーン印刷電極。磁気ビーズとAPの基質との間のインキュベーションの2分後、酵素製品は、ポータブル機器（PalmSens）数秒以内の間隔で自動的にeight測定を開始することを用いて微分パルスボルタンメトリー（DPV）によって検出されます。

Watch this Scientific Journal Video about ELIME Enzyme Linked Immuno Magnetic Electrochemical Method for Mycotoxin Detection at JoVE.com

ELIME Enzyme Linked Immuno Magnetic Electrochemical Method for Mycotoxin Detection

競争力のある免疫化学的方法に基づいて新たに開発されたスクリーニング方法を用いてトリコテセン（ヒトの健康に対する懸念のマイコトキシン）を検出すると、最終的な電気化学的検出が実証されているプロトコル。

ELIME（免疫磁気電気化学的にリンクされた酵素）マイコトキシンの検出方法

Immunoassays are a valid alternative to the more expensive and time consuming quantitative HPLC or GC1, 2 methods for the screening detection of hazardous ...

Research

JoVE Journal

Biology

ELIME (Enzyme Linked Immuno Magnetic Electrochemical) Method for Mycotoxin Detection

Detection of Protein Ubiquitination

タンパク質のユビキチン化の検出

Ubiquitination, the covalent attachment of the polypeptide ubiquitin to target proteins, is a key posttranslational modification carried out by a set of ...

生物学

Isolation of Labile Multi-protein Complexes by in vivo Controlled Cellular Cross-Linking and Immuno-magnetic Affinity Chromatography

Isolation of Labile Multi-protein Complexes by in vivo Controlled Cellular Cross-Linking and Immuno-magnetic Affinity Chromatography

不安定な多タンパク質複合体の単離で in vivoで制御セルラー架橋及び免疫磁気アフィニティークロマトグラフィー

The dynamic nature of cellular machineries is frequently built on transient and/or weak protein associations. These low affinity interactions preclude ...

Pulse-chase Analysis of N-linked Sugar Chains from Glycoproteins in Mammalian Cells

哺乳動物細胞での糖タンパク質からN -結合型糖鎖のパルス - チェイス分析

Attachment of the Glc3Man9GlcNAc2 precursor oligosaccharide to nascent polypeptides in the ER is a common modification for secretory proteins. Although ...

Rapid Homogeneous Detection of Biological Assays Using Magnetic Modulation Biosensing System

磁気変調バイオセンシングシステムを用いた生物学的アッセイの迅速な均質な検出

A magnetic modulation biosensing system (MMB) [1,2] rapidly and homogeneously detected biological targets at low concentrations without any washing or ...

Direct Detection of the Acetate-forming Activity  of the Enzyme Acetate Kinase

酵素酢酸キナーゼのアセテート形成活性の直接検出

Acetate kinase, a member of the acetate and sugar kinase-Hsp70-actin (ASKHA) enzyme superfamily1-5, is responsible for the reversible phosphorylation of ...

Electroantennographic Bioassay as a Screening Tool for Host Plant Volatiles

宿主植物の揮発性物質のスクリーニングツールとしてElectroantennographicバイオアッセイ

Plant volatiles play an important role in plant-insect interactions. Herbivorous insects use plant volatiles, known as kairomones, to locate their host ...

qPCR Is a Sensitive and Rapid Method for Detection of Cytomegaloviral DNA in Formalin-fixed, Paraffin-embedded Biopsy Tissue

定量PCRは、ホルマリン固定、パラフィン包埋された生検組織中のサイトメガロウイルスDNAの検出のための高感度かつ迅速な方法であり、

It is crucial to identify cytomegalovirus (CMV) infection in the gastrointestinal (GI) tract of immunosuppressed patients, given their greater risk for ...

Multi-enzyme Screening Using a High-throughput Genetic Enzyme Screening System

マルチ酵素ハイスループット遺伝的酵素スクリーニングシステムを用いたスクリーニング

The recent development of a high-throughput single-cell assay technique enables the screening of novel enzymes based on functional activities from a ...

Nuclei Isolation from Whole Tissue using a Detergent and Enzyme-Free Method

洗浄剤と酵素を含まない方法を用いた組織全体からの核分離

High-throughput transcriptome and epigenome profiling requires preparation of a single cell or single nuclei suspension. Preparation of the suspension ...

Detection of Plasmodium Sporozoites in Anopheles Mosquitoes using an Enzyme-linked Immunosorbent Assay

Detection of Plasmodium Sporozoites in Anopheles Mosquitoes using an Enzyme-linked Immunosorbent Assay

酵素結合免疫吸着アッセイを用いたハマダラカ蚊におけるマラリア原虫スポロゾイトの検出

Plasmodium sporozoites are the infective stage of malaria parasites that infect humans. The sporozoites residing in the salivary glands of female ...