Name: isolation and purification of drosophila peripheral neurons by magnetic bead sorting
Uploaded: 2009-12-01T14:59:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolation and Purification of Drosophila Peripheral Neurons by Magnetic Bead Sorting at JoVE.com

Wij danken Drs. Yuh-Nung Jan en Wes Grueber voor het aanbieden van vliegen voorraden die in deze studie. De auteurs erkennen de Thomas F. en Kate Miller Jeffress Memorial Trust voor de ondersteuning van dit onderzoek (DNC) en de George Mason University Provost&#39;s Office (EPRI).

Algemeen Reacties op Magnetic Bead sorteren van Drosophila perifere neuronen (Totaal Timing voor de voltooiing van het protocol: 2,5-3 uur) Standaard lab procedures voor het handhaven van een schone, RNAse vrije omgeving moeten worden nageleefd te allen tijde RNA degradatie te voorkomen. Wanneer de Drosophila larven cuticula is ontleed en geplaatst in de cel dissociatie buffer, de perifere neuronen zijn een van de laatste cellen los te maken van...

<ol>
	<li>Corty, M. M., Matthews, B. J., Grueber, W. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecules+and+mechanisms+of+dendrite+development+in+Drosophila.">Molecules and mechanisms of dendrite development in Drosophila.</a> Development. 136, 1049-1061 (2009).</li><li>Parrish, J. Z., Emoto, K., Kim, ., Jan, Y. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+that+regulate+establishment,+maintenance,+and+remodeling+of+dendritic+fields.">Mechanisms that regulate establishment, maintenance, and remodeling of dendritic fields.</a> Ann. Rev. Neurosci. 30, 399-423 (2007).</li><li>Lee, T., Luo, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mosaic+analysis+with+a+repressible+cell+marker+for+studies+of+gene+function+in+neuronal+morphogenesis.">Mosaic analysis with a repressible cell marker for studies of gene function in neuronal morphogenesis.</a> Neuron. 22, 451-461 (1999).</li><li>Grueber, W. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Projections+of+Drosophila+multidendritic+neurons+in+the+central+nervous+system:+links+with+peripheral+dendrite+morphology.">Projections of Drosophila multidendritic neurons in the central nervous system: links with peripheral dendrite morphology.</a> Development. 134, 55-64 (2007).</li><li>Song, W., Onishi, M., Jan, L. Y., Jan, Y. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Peripheral+multidendritic+sensory+neurons+are+necessary+for+rhythmic+locomotion+behavior+in+Drosophila+larvae.">Peripheral multidendritic sensory neurons are necessary for rhythmic locomotion behavior in Drosophila larvae.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 104, 5199-5204 (2007).</li><li>Livak, K. J., Schmittgen, T. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+relative+gene+expression+data+using+real-time+quantitative+PCR+and+the+2(-Delta+Delta+C(T))+methods.">Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2(-Delta Delta C(T)) methods.</a> Methods. 25, 402-408 (2001).</li></ol>

Het protocol hier gepresenteerde is geoptimaliseerd voor de isolatie en zuivering van de perifere neuronen die strak te houden aan de binnenkant van de Drosophila derde instar larven nagelriemen met behulp van een magnetisch bolletje celsortering strategie. Hoewel we hebben gebruikt dit protocol om specifiek Drosophila da neuronen, toepassingen van dit protocol te isoleren om het isolement van andere celtypen die voldoen aan de cuticula in larve-of popstadium stadia van ontwikkeling (bijvoorbeeld epitheel, spieren, ande...

Uitrusting <ul><li> (10) Neodymium magneten blok (K &amp; J Magnetics, Inc, Cat. # B444B), als alternatief DynaMag ™ -2 (Invitrogen, Cat. # 123-21D) kan worden gebruikt. </li><li> Kontes glasvlies Grinder, 2 ml van de arbeidsgeschiktheid, met een grote ruimte pestle (Cat. # 885.300 tot 0,002) </li><li> Cel filters, bijvoorbeeld MACS Pre-Separation Filter (Miltenyi Biotec, Cat. # 130-041-407) </li><li> 35 mm petri-schalen bekleed met Sylgard (Dow Corning Corporation, Cat. # 3097358 tot 1004) </li><li> Ontleden tools: twee paren van Dumont nr. 5 pincet (Fine Science Tools, Cat # 11251-20). </li><li> Vannas lente micro-dissectie schaar (Fine Science Tools, Cat. # 15000-08) </li><li> Pipetten (P-1000, P-100, P-10) met disposable tips </li><li> Standaard hemocytometer naar de cellen en een schatting zuiverheid tellen </li><li> Pasteurpipetten met vuur gepolijste uiteinden van de standaard diameter, gedaald tot ~ 50% van de standaard diameter en versmald tot ~ 25% van de standaard diameter voor tritureren </li><li> Tafelblad micro-centrifuge (1-16,000 (x) g) </li><li> Draaikolk </li><li> TL-stereo-microscoop (een Leica MZ16FA werd gebruikt in dit protocol) </li></ul>

isolation and purification of drosophila peripheral neurons by magnetic bead sorting

De<em&gt; Drosophila</em&gt; Perifere zenuwstelsel (PNS) is een krachtig model voor het onderzoeken van de complexe processen van neuronale ontwikkeling en dendrieten morfogenese bij de functionele en moleculair niveau. Om te helpen in deze analyses, hebben wij een strategie ontwikkeld voor de isolatie van een subklasse van PNS neuronen genaamd dendritische arborization (da) neuronen die op grote schaal gebruikt voor het bestuderen van dendriet morfogenese<sup&gt; 1,2</sup&gt;. Deze neuronen zijn zeer moeilijk te isoleren als een zuivere populatie, mede door hun extreem lage optreden en hun moeilijk te bereiken locatie onder de stoere chitinous larvale cuticula. Onze nieuw ontwikkelde methode overwint deze uitdagingen, en is gebaseerd op een snelle en specifieke cel verrijking met behulp van antilichaam-gecoate magnetische korrels. Voor onze magnetische kraal sorteren studies, hebben we gebruik gemaakt van dezelfde leeftijd derde instar larven uiten van een muis CD8 gelabeld GFP fusie-eiwit (<em&gt; UAS-mCD8-GFP</em&gt;)<sup&gt; 3</sup&gt; Onder de controle van zowel de klasse IV dendritische arborization (da) neuron-specifieke<em&gt; Zakkenroller (PPK)-GAL4</em&gt; Driver<sup&gt; 4</sup&gt; Of de controle van het pan-da neuron-specifieke GAL4<sup&gt; 21-7</sup&gt; Driver<sup&gt; 5</sup&gt;. Hoewel dit protocol is geoptimaliseerd voor het isoleren van PNS-cellen, die zijn bevestigd aan de binnenwand van de larvale cuticula, door het variëren van een paar parameters, zou hetzelfde protocol gebruikt worden om veel verschillende soorten cellen aan de cuticula op larve of popstadium stadia van isoleren ontwikkeling (bijvoorbeeld epitheel, spier, oenocytes enz.), of andere celtypen uit larvale organen afhankelijk van de GAL4-specifieke driver expressie patroon. Het RNA geïsoleerd door deze methode is van hoge kwaliteit en kunnen gemakkelijk worden gebruikt voor de downstream-genomische analyses, zoals microarray genexpressie studies. Deze aanpak biedt een krachtige nieuwe tool om studies uit te voeren op geïsoleerde<em&gt; Drosophila</em&gt; Dendritische arborization (da) neuronen waardoor het verstrekken van nieuwe inzichten in de moleculaire mechanismen die ten grondslag liggen dendriet morfogenese.

Watch this Scientific Journal Video about Isolation and Purification of Drosophila Peripheral Neurons by Magnetic Bead Sorting at JoVE.com

Isolation and Purification of Drosophila Peripheral Neurons by Magnetic Bead Sorting

In deze video-artikel stellen we een methode voor de isolatie en zuivering van<em&gt; Drosophila</em&gt; Perifere neuronen met behulp van een snelle magnetische kraal bijgestaan ​​celsortering strategie. RNA verkregen uit de geïsoleerde cellen kunnen gemakkelijk worden gebruikt voor downstream-toepassingen zoals microarray-analyses.

Isolatie en zuivering van Drosophila Perifere neuronen door Magnetic Bead sorteren

The Drosophila peripheral nervous system (PNS) is a powerful model for investigating the complex processes of neuronal development and dendrite ...

Research

JoVE Journal

Biology

Isolation and Purification of Drosophila Peripheral Neurons by Magnetic Bead Sorting

Staining of Proteins in Gels with Coomassie G-250 without Organic Solvent and Acetic Acid

Kleuring van eiwitten in Gels met Coomassie G-250 zonder organisch oplosmiddel en azijnzuur

In classical protein staining protocols using Coomassie Brilliant Blue (CBB), solutions with high contents of toxic and flammable organic solvents ...

Isolation of Labile Multi-protein Complexes by in vivo Controlled Cellular Cross-Linking and Immuno-magnetic Affinity Chromatography

Isolation of Labile Multi-protein Complexes by in vivo Controlled Cellular Cross-Linking and Immuno-magnetic Affinity Chromatography

Isolatie van labiele Multi-eiwit-complexen door In vivo Gecontroleerde Cellulaire Cross-Linking and Immuno-magnetische affiniteitschromatografie

The dynamic nature of cellular machineries is frequently built on transient and/or weak protein associations. These low affinity interactions preclude ...

Isolation of Drosophila melanogaster Testes

Isolation of Drosophila melanogaster Testes

Isolatie van Drosophila melanogaster Testes

The testes of Drosophila melanogaster provide an important model for the study of stem cell maintenance and differentiation, meiosis, and soma-germline ...

Isolation and Purification of Kinesin from Drosophila Embryos

Isolation and Purification of Kinesin from Drosophila Embryos

Isolatie en zuivering van kinesine uit Drosophila Embryo&#39;s

Motor proteins move cargos along microtubules, and transport them to specific sub-cellular locations. Because altered transport is suggested to underlie a ...

Chromatin Isolation by RNA Purification (ChIRP)

Chromatin Isolation by RNA Purification ChIRP

Chromatine Isolatie door RNA-zuivering (Chirp)

Long noncoding RNAs are key regulators of chromatin states for important biological processes such as dosage compensation, imprinting, and developmental ...

Isolation of Normal and Cancer-associated Fibroblasts from Fresh Tissues by Fluorescence Activated Cell Sorting (FACS)

Isolation of Normal and Cancer-associated Fibroblasts from Fresh Tissues by Fluorescence Activated Cell Sorting FACS

Isolatie van normale en kankergeassocieerde fibroblasten van verse weefsels door fluorescentie-geactiveerde celsortering (FACS)

Cancer-associated fibroblasts (CAFs) are the most prominent cell type within the tumor stroma of many cancers, in particular breast carcinoma, and their ...

Purification of Transcripts and Metabolites from Drosophila Heads

Purification of Transcripts and Metabolites from Drosophila Heads

Zuivering van Afschriften en metabolieten van<em&gt; Drosophila</em&gt; Hoofden

For the last decade, we have tried to understand the molecular and cellular mechanisms of neuronal degeneration using Drosophila as a model organism. ...

Organelle Transport in Cultured Drosophila Cells: S2 Cell Line and Primary Neurons.

Organelle Transport in Cultured Drosophila Cells: S2 Cell Line and Primary Neurons.

Organel Transport in gekweekte<em&gt; Drosophila</em&gt; Cellen: S2 cellijn en primaire neuronen.

Drosophila S2 cells plated on a coverslip in the presence of any actin-depolymerizing drug form long unbranched processes filled with uniformly polarized ...

Identifying Protein-protein Interaction in Drosophila Adult Heads by Tandem Affinity Purification (TAP)

Identifying Protein-protein Interaction in Drosophila Adult Heads by Tandem Affinity Purification TAP

Het identificeren van eiwit-eiwit interactie in<em&gt; Drosophila</em&gt; Adult Heads door Tandem Affinity Purification (TAP)

Genetic screens conducted using Drosophila melanogaster (fruit fly) have made numerous milestone discoveries in the advance of biological sciences. ...

Rapid Isolation And Purification Of Mitochondria For Transplantation By Tissue Dissociation And Differential Filtration

Rapid isolatie en zuivering van Mitochondriën voor transplantatie Door Tissue Dissociatie en differentiële Filtratie

Previously described mitochondrial isolation methods using differential centrifugation and/or Ficoll gradient centrifugation require 60 to 100 min to ...