Name: isolation and purification of drosophila peripheral neurons by magnetic bead sorting
Uploaded: 2009-12-01T14:59:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolation and Purification of Drosophila Peripheral Neurons by Magnetic Bead Sorting at JoVE.com

Nous remercions les Drs. Yuh-Nung Jan et Wes Grueber pour fournir des stocks volantes utilisées dans cette étude. Les auteurs remercient F. Thomas et Kate Miller Jeffress Memorial Trust pour le soutien de cette recherche (DNC) et le Bureau du l&#39;Université George Mason Provost (EPRI).

Commentaires généraux sur le tri des billes magnétiques neurones périphériques drosophile (Timing Total pour l&#39;achèvement du Protocole: 2.5-3 heures) Procédures de laboratoire standard pour maintenir un environnement propre, RNAse environnement libre doivent être respectées en tout temps pour prévenir la dégradation de l&#39;ARN. Lorsque la cuticule des larves de drosophile est disséqué et placé dans le buffer dissociation cell...

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	<li>Corty, M. M., Matthews, B. J., Grueber, W. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecules+and+mechanisms+of+dendrite+development+in+Drosophila.">Molecules and mechanisms of dendrite development in Drosophila.</a> Development. 136, 1049-1061 (2009).</li><li>Parrish, J. Z., Emoto, K., Kim, ., Jan, Y. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+that+regulate+establishment,+maintenance,+and+remodeling+of+dendritic+fields.">Mechanisms that regulate establishment, maintenance, and remodeling of dendritic fields.</a> Ann. Rev. Neurosci. 30, 399-423 (2007).</li><li>Lee, T., Luo, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mosaic+analysis+with+a+repressible+cell+marker+for+studies+of+gene+function+in+neuronal+morphogenesis.">Mosaic analysis with a repressible cell marker for studies of gene function in neuronal morphogenesis.</a> Neuron. 22, 451-461 (1999).</li><li>Grueber, W. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Projections+of+Drosophila+multidendritic+neurons+in+the+central+nervous+system:+links+with+peripheral+dendrite+morphology.">Projections of Drosophila multidendritic neurons in the central nervous system: links with peripheral dendrite morphology.</a> Development. 134, 55-64 (2007).</li><li>Song, W., Onishi, M., Jan, L. Y., Jan, Y. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Peripheral+multidendritic+sensory+neurons+are+necessary+for+rhythmic+locomotion+behavior+in+Drosophila+larvae.">Peripheral multidendritic sensory neurons are necessary for rhythmic locomotion behavior in Drosophila larvae.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 104, 5199-5204 (2007).</li><li>Livak, K. J., Schmittgen, T. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+relative+gene+expression+data+using+real-time+quantitative+PCR+and+the+2(-Delta+Delta+C(T))+methods.">Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2(-Delta Delta C(T)) methods.</a> Methods. 25, 402-408 (2001).</li></ol>

Le protocole présenté ici est optimisé pour l&#39;isolement et la purification des neurones périphériques qui adhèrent fermement à la surface interne de la cuticule drosophile troisième stade larvaire en utilisant une stratégie de billes magnétiques tri cellulaire. Alors que nous avons utilisé ce protocole pour isoler spécifiquement drosophile neurones DA, les applications de ce protocole à l&#39;isolement des autres types de cellules qui adhèrent à la cuticule larvaire ou pupal de développement (par exe...

Équipement <ul><li> (10) aimants néodyme de bloc (Magnetics J &amp; K, Inc, Cat. # B444B), alternativement dynamag ™ -2 (Invitrogen, Cat. # 123-21D) peut être utilisé. </li><li> Grinder Kontes tissu de verre, 2 ml de capacité de travail, avec un pilon grand dégagement (Cat. # 885300-0002) </li><li> Filtres cellulaire, par exemple MACS Pré-Séparation Filtre (Miltenyi Biotec, Cat. # 130-041-407) </li><li> Pétri de 35 mm-plats revêtus d&#39;Sylgard (Dow Corning Corporation, Cat. # 3097358-1004) </li><li> Des outils de dissection: deux paires de pinces à Dumont n ° 5 (Outils Fine Science, n ° de cat 11251-20.) </li><li> Vannas printemps micro-dissection ciseaux (Outils Fine Science, Cat. # 15000-08) </li><li> Pipettes (P-1000, P-100, P-10) avec embouts jetables </li><li> Hémocytomètre standard pour compter les cellules et la pureté devis </li><li> Pipettes Pasteur avec des conseils polies au feu de diamètre standard, réduit à ~ 50% du diamètre standard et réduit à ~ 25% du diamètre standard pour la trituration </li><li> Table top micro-centrifugeuse (1-16,000 (x) g) </li><li> Vortex </li><li> Fluorescent stéréomicroscope (une MZ16FA Leica a été utilisé dans ce protocole) </li></ul>

isolation and purification of drosophila peripheral neurons by magnetic bead sorting

L&#39;<em&gt; Drosophile</em&gt; Système nerveux périphérique (SNP) est un modèle puissant pour étudier les processus complexes du développement neuronal et la morphogenèse des dendrites au niveau moléculaire et fonctionnelle. Pour faciliter ces analyses, nous avons développé une stratégie pour l&#39;isolement d&#39;une sous-classe de neurones du SNP appelé arborisation dendritique (bis) les neurones qui ont été largement utilisées pour l&#39;étude de la morphogenèse dendrite<sup&gt; 1,2</sup&gt;. Ces neurones sont très difficiles à isoler comme une population pure, due en partie à leur occurrence extrêmement faible et leur difficulté à atteindre l&#39;emplacement ci-dessous la cuticule larvaire dure de chitine. Notre méthode nouvellement développée permet de surmonter ces défis, et est basé sur un enrichissement cellulaire rapide et précis à l&#39;aide d&#39;anticorps billes magnétiques recouvertes. Pour nos études de tri magnétique perles, nous avons utilisé appariés selon l&#39;âge des larves troisième stade exprimer une souris CD8 marqués protéine de fusion GFP (<em&gt; UAS-GFP-mCD8</em&gt;)<sup&gt; 3</sup&gt; Sous le contrôle de soit l&#39;arborisation dendritique de classe IV (da) spécifique des neurones<em&gt; Pickpocket (PPK)-GAL4</em&gt; Chauffeur<sup&gt; 4</sup&gt; Ou le contrôle de la pan-da spécifique des neurones GAL4<sup&gt; 21-7</sup&gt; Chauffeur<sup&gt; 5</sup&gt;. Bien que ce protocole a été optimisé pour isoler les cellules du SNP qui sont attachés à la paroi interne de la cuticule des larves, en faisant varier quelques paramètres, le même protocole pourrait être utilisé pour isoler de nombreux types cellulaires différents attaché à la cuticule au stade larvaire ou nymphal des développement (par exemple l&#39;épithélium, le muscle, oenocytes etc), ou d&#39;autres types cellulaires à partir d&#39;organes larvaires en fonction du motif de GAL4-pilote spécifique d&#39;expression. L&#39;ARN isolé par cette méthode est de haute qualité et peut être facilement utilisé pour les analyses génomiques aval telles que les études génétiques biopuces profilage de l&#39;expression. Cette approche offre un nouvel outil puissant pour effectuer des études sur les isolés<em&gt; Drosophile</em&gt; Dendritiques arborisation (da) neurones fournissant ainsi de nouvelles connaissances sur les mécanismes moléculaires qui sous-tendent la morphogenèse des dendrites.

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Isolation and Purification of Drosophila Peripheral Neurons by Magnetic Bead Sorting

Dans cette vidéo, article, nous présentons une méthode pour l&#39;isolement et la purification de<em&gt; Drosophile</em&gt; Neurones périphériques en utilisant une bille magnétique rapide stratégie assisté tri cellulaire. ARN obtenu à partir des cellules isolées peuvent être facilement utilisés pour des applications en aval y compris les analyses de biopuces.

Isolement et purification de Drosophile Neurones périphériques en triant bille magnétique

The Drosophila peripheral nervous system (PNS) is a powerful model for investigating the complex processes of neuronal development and dendrite ...

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