Name: isolation and purification of drosophila peripheral neurons by magnetic bead sorting
Uploaded: 2009-12-01T14:59:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolation and Purification of Drosophila Peripheral Neurons by Magnetic Bead Sorting at JoVE.com

Wir danken Drs. Yuh-Nung Jan und Wes Grueber für die Bereitstellung von fly Aktien in dieser Studie verwendet. Die Autoren danken Thomas F. und Kate Miller Jeffress Memorial Trust für die Unterstützung dieser Forschung (DNC) und der George Mason University Provost Büro (EPRI).

Allgemeine Kommentare zu Magnetic Bead Sortieren von Drosophila peripheren Neuronen (Total Timing für die Fertigstellung des Protokolls: 2.5-3 Stunden) Standard-Laborverfahren für die Beibehaltung einer sauberen, RNAse freien Umgebung muss jederzeit beobachtet werden, um RNA-Abbau zu verhindern. Wenn der Drosophila Larvencuticula seziert wird und in der Zelle Dissoziationspuffer, sind die peripheren Neuronen eines der letzten Zellen aus der Ob...

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	<li>Corty, M. M., Matthews, B. J., Grueber, W. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecules+and+mechanisms+of+dendrite+development+in+Drosophila.">Molecules and mechanisms of dendrite development in Drosophila.</a> Development. 136, 1049-1061 (2009).</li><li>Parrish, J. Z., Emoto, K., Kim, ., Jan, Y. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+that+regulate+establishment,+maintenance,+and+remodeling+of+dendritic+fields.">Mechanisms that regulate establishment, maintenance, and remodeling of dendritic fields.</a> Ann. Rev. Neurosci. 30, 399-423 (2007).</li><li>Lee, T., Luo, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mosaic+analysis+with+a+repressible+cell+marker+for+studies+of+gene+function+in+neuronal+morphogenesis.">Mosaic analysis with a repressible cell marker for studies of gene function in neuronal morphogenesis.</a> Neuron. 22, 451-461 (1999).</li><li>Grueber, W. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Projections+of+Drosophila+multidendritic+neurons+in+the+central+nervous+system:+links+with+peripheral+dendrite+morphology.">Projections of Drosophila multidendritic neurons in the central nervous system: links with peripheral dendrite morphology.</a> Development. 134, 55-64 (2007).</li><li>Song, W., Onishi, M., Jan, L. Y., Jan, Y. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Peripheral+multidendritic+sensory+neurons+are+necessary+for+rhythmic+locomotion+behavior+in+Drosophila+larvae.">Peripheral multidendritic sensory neurons are necessary for rhythmic locomotion behavior in Drosophila larvae.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 104, 5199-5204 (2007).</li><li>Livak, K. J., Schmittgen, T. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+relative+gene+expression+data+using+real-time+quantitative+PCR+and+the+2(-Delta+Delta+C(T))+methods.">Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2(-Delta Delta C(T)) methods.</a> Methods. 25, 402-408 (2001).</li></ol>

Das Protokoll hier vorgestellten ist für die Isolierung und Aufreinigung von peripheren Neuronen, die eng an die innere Oberfläche der Drosophila dritten Larvenstadium Larvencuticula mit einer Magnetic-Bead-cell sorting Strategie festhalten optimiert. Während wir dieses Protokoll verwendet haben, um gezielt zu isolieren Drosophila da Neuronen, Anwendungen dieses Protokoll, um die Isolation von anderen Zelltypen, die die Kutikula in Larven-oder Puppenstadium Entwicklungsstadien haften (zB Epithelien, Muskeln, andere p...

Ausstattung <ul><li> (10) Neodym-Magneten Block (K &amp; J Magnetics, Inc., Cat. # B444B), alternativ Dynamag ™ -2 (Invitrogen, Cat. Nr. 123-21D) verwendet werden. </li><li> Kontes Glass Tissue Grinder, 2 ml Arbeitsfähigkeit, mit großem Abstand Stößel (Kat. Nr. 885300-0002) </li><li> Zell-Filter, z. B. MACS Pre-Separation Filter (Miltenyi Biotec, Cat. # 130-041-407) </li><li> 35 mm Petrischalen mit Sylgard (Dow Corning Corporation, Cat. # 3097358 bis 1004) beschichtet </li><li> Dissecting Werkzeuge: zwei Paare von Dumont Nr. 5 Pinzetten (Fine Science Tools, Kat. Nr. 11251-20.) </li><li> Vannas Frühjahr Mikrodissektion Schere (Fine Science Tools, Cat. # 15000-08) </li><li> Pipetten (P-1000, P-100, P-10) mit Einwegspitzen </li><li> Standard-Zählkammer die Zellen und schätzen Reinheit zählen </li><li> Pasteurpipetten mit Feuer polierte Spitzen von Standard-Durchmesser verengt, um ~ 50% der Standard-Durchmesser und verengt auf ~ 25% der Standard-Durchmesser für Verreibung </li><li> Tischplatte Mikro-Zentrifuge (1-16,000 (x) g) </li><li> Wirbel </li><li> Fluorescent Stereo-Mikroskop (Leica MZ16FA wurde in diesem Protokoll) </li></ul>

isolation and purification of drosophila peripheral neurons by magnetic bead sorting

Die<em&gt; Drosophila</em&gt; Peripheren Nervensystem (PNS) ist ein leistungsfähiges Modell für die Untersuchung der komplexen Prozesse der neuronalen Entwicklung und Dendriten Morphogenese bei der funktionalen und molekularer Ebene. Zur Unterstützung bei diesen Analysen haben wir eine Strategie für die Isolierung von einer Unterklasse von PNS Neuronen so genannten dendritischen Verzweigung (da) Neuronen, die in großem Umfang für das Studium Dendriten Morphogenese verwendet entwickelt<sup&gt; 1,2</sup&gt;. Diese Neuronen sind sehr schwierig, da eine reine Population isoliert, zum Teil aufgrund ihrer extrem geringen Vorkommens und ihrer schwer zu erreichen Lage direkt unterhalb der harten Chitinpanzer Larvencuticula. Unsere neu entwickelte Verfahren überwindet diese Herausforderungen, und ist auf eine schnelle und spezifische Anreicherung von Zellen mit Antikörper-beschichteten magnetischen Kügelchen auf. Für unsere Magnetic-Bead-Sortier-Studien haben wir altersmäßig angepassten dritten Larvenstadium eingesetzt Ausdruck einer Maus CD8 getaggt GFP-Fusionsprotein (<em&gt; FH-mCD8-GFP</em&gt;)<sup&gt; 3</sup&gt; Unter der Kontrolle von entweder der Klasse IV dendritische Verzweigung (da) Neuronen-spezifische<em&gt; Taschendieb (PPK)-GAL4</em&gt; Fahrer<sup&gt; 4</sup&gt; Oder die Steuerung der pan-da Neuronen-spezifische GAL4<sup&gt; 21-7</sup&gt; Fahrer<sup&gt; 5</sup&gt;. Obwohl dieses Protokoll für die Isolierung von PNS-Zellen, die an der Innenwand des Larvencuticula befestigt sind, durch die Variation einiger Parameter optimiert wurden, konnte das gleiche Protokoll verwendet, um viele verschiedene Zelltypen an der Nagelhaut an Larven oder Puppen Phasen zu isolieren Entwicklung (z. B. Epithelien, Muskel-, oenocytes etc.) oder andere Zelltypen aus Larvenorgane abhängig von der GAL4-spezifischen Treiber Expressionsmuster. Die RNA durch diese Methode isoliert ist von hoher Qualität und kann ohne weiteres für nachgeschaltete genomische Analysen wie Microarray Gene Expression Profiling Studien verwendet werden. Dieser Ansatz bietet ein leistungsstarkes neues Werkzeug, um Untersuchungen an isolierten durchführen<em&gt; Drosophila</em&gt; Dendritische Verzweigung (da) Neuronen wodurch neue Einblicke in die zugrunde liegenden molekularen Mechanismen Dendriten Morphogenese.

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Isolation and Purification of Drosophila Peripheral Neurons by Magnetic Bead Sorting

In diesem Video-Artikel präsentieren wir ein Verfahren zur Isolierung und Aufreinigung von<em&gt; Drosophila</em&gt; Peripheren Neuronen mit einem schnellen Magnetic Bead Zellsorting Strategie. RNA aus den isolierten Zellen erhalten kann ohne weiteres für nachgelagerte Anwendungen einschließlich Microarray-Analysen verwendet werden.

Isolierung und Reinigung von Drosophila Peripheren Neuronen durch Magnetic Bead Sorting

The Drosophila peripheral nervous system (PNS) is a powerful model for investigating the complex processes of neuronal development and dendrite ...

Research

JoVE Journal

Biology

Isolation and Purification of Drosophila Peripheral Neurons by Magnetic Bead Sorting

Staining of Proteins in Gels with Coomassie G-250 without Organic Solvent and Acetic Acid

Färbung von Proteinen in Gelen mit Coomassie G-250 ohne organische Lösungsmittel und Essigsäure

In classical protein staining protocols using Coomassie Brilliant Blue (CBB), solutions with high contents of toxic and flammable organic solvents ...

Forschung

Biologie

Isolation of Labile Multi-protein Complexes by in vivo Controlled Cellular Cross-Linking and Immuno-magnetic Affinity Chromatography

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Isolierung von Labile Multi-Protein-Komplexe durch In vivo Kontrollierte Cellular Cross-Linking und Immuno-magnetische Affinitätschromatographie

The dynamic nature of cellular machineries is frequently built on transient and/or weak protein associations. These low affinity interactions preclude ...

Isolation of Drosophila melanogaster Testes

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Isolierung von Drosophila melanogaster Testes

The testes of Drosophila melanogaster provide an important model for the study of stem cell maintenance and differentiation, meiosis, and soma-germline ...

Isolation and Purification of Kinesin from Drosophila Embryos

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Isolierung und Reinigung von Kinesin aus Drosophila Embryonen

Motor proteins move cargos along microtubules, and transport them to specific sub-cellular locations. Because altered transport is suggested to underlie a ...

Chromatin Isolation by RNA Purification (ChIRP)

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Chromatin Isolierung von RNA-Reinigung (Chirp)

Long noncoding RNAs are key regulators of chromatin states for important biological processes such as dosage compensation, imprinting, and developmental ...

Isolation of Normal and Cancer-associated Fibroblasts from Fresh Tissues by Fluorescence Activated Cell Sorting (FACS)

Isolation of Normal and Cancer-associated Fibroblasts from Fresh Tissues by Fluorescence Activated Cell Sorting FACS

Isolation von Normal und Krebs-assoziierte Fibroblasten von Fresh Gewebe durch Fluorescence Activated Cell Sorting (FACS)

Cancer-associated fibroblasts (CAFs) are the most prominent cell type within the tumor stroma of many cancers, in particular breast carcinoma, and their ...

Purification of Transcripts and Metabolites from Drosophila Heads

Purification of Transcripts and Metabolites from Drosophila Heads

Reinigung von Transcripts und Metaboliten aus<em&gt; Drosophila</em&gt; Köpfe

For the last decade, we have tried to understand the molecular and cellular mechanisms of neuronal degeneration using Drosophila as a model organism. ...

Organelle Transport in Cultured Drosophila Cells: S2 Cell Line and Primary Neurons.

Organelle Transport in Cultured Drosophila Cells: S2 Cell Line and Primary Neurons.

Organell-Transport in kultivierten<em&gt; Drosophila</em&gt; Zellen: S2-Zelllinie und primären Neuronen.

Drosophila S2 cells plated on a coverslip in the presence of any actin-depolymerizing drug form long unbranched processes filled with uniformly polarized ...

Identifying Protein-protein Interaction in Drosophila Adult Heads by Tandem Affinity Purification (TAP)

Identifying Protein-protein Interaction in Drosophila Adult Heads by Tandem Affinity Purification TAP

Identifizierung von Protein-Protein-Wechselwirkung in<em&gt; Drosophila</em&gt; Adult Heads von Tandem Affinity Purification (TAP)

Genetic screens conducted using Drosophila melanogaster (fruit fly) have made numerous milestone discoveries in the advance of biological sciences. ...

Rapid Isolation And Purification Of Mitochondria For Transplantation By Tissue Dissociation And Differential Filtration

Schnelle Isolierung und Reinigung von Mitochondrien für die Transplantation von Gewebe-Dissoziation und Differential Filtration

Previously described mitochondrial isolation methods using differential centrifugation and/or Ficoll gradient centrifugation require 60 to 100 min to ...