Name: isolation and purification of drosophila peripheral neurons by magnetic bead sorting
Uploaded: 2009-12-01T14:59:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolation and Purification of Drosophila Peripheral Neurons by Magnetic Bead Sorting at JoVE.com

אנו מודים בני הזוג. Yuh-Nung יאן ווס Grueber למתן מניות לטוס השתמשו במחקר זה. המחברים להכיר תומס פ קייט מילר Jeffress הזיכרון אמון על התמיכה של מחקר זה (DNC) ו-Office ג&#39;ורג&#39; מייסון האוניברסיטה מכללה (EPRI).

הערות כלליות על מיון ביד מגנטית של הנוירונים תסיסנית היקפיים (עיתוי סך להשלמת לפרוטוקול: 2.5-3 שעות) נהלי מעבדה רגיל לשמירה על סביבה נקייה, RNAse חינם יש לשמור בכל עת על מנת למנוע הידרדרות RNA. כ...

<ol>
	<li>Corty, M. M., Matthews, B. J., Grueber, W. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecules+and+mechanisms+of+dendrite+development+in+Drosophila.">Molecules and mechanisms of dendrite development in Drosophila.</a> Development. 136, 1049-1061 (2009).</li><li>Parrish, J. Z., Emoto, K., Kim, ., Jan, Y. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+that+regulate+establishment,+maintenance,+and+remodeling+of+dendritic+fields.">Mechanisms that regulate establishment, maintenance, and remodeling of dendritic fields.</a> Ann. Rev. Neurosci. 30, 399-423 (2007).</li><li>Lee, T., Luo, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mosaic+analysis+with+a+repressible+cell+marker+for+studies+of+gene+function+in+neuronal+morphogenesis.">Mosaic analysis with a repressible cell marker for studies of gene function in neuronal morphogenesis.</a> Neuron. 22, 451-461 (1999).</li><li>Grueber, W. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Projections+of+Drosophila+multidendritic+neurons+in+the+central+nervous+system:+links+with+peripheral+dendrite+morphology.">Projections of Drosophila multidendritic neurons in the central nervous system: links with peripheral dendrite morphology.</a> Development. 134, 55-64 (2007).</li><li>Song, W., Onishi, M., Jan, L. Y., Jan, Y. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Peripheral+multidendritic+sensory+neurons+are+necessary+for+rhythmic+locomotion+behavior+in+Drosophila+larvae.">Peripheral multidendritic sensory neurons are necessary for rhythmic locomotion behavior in Drosophila larvae.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 104, 5199-5204 (2007).</li><li>Livak, K. J., Schmittgen, T. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+relative+gene+expression+data+using+real-time+quantitative+PCR+and+the+2(-Delta+Delta+C(T))+methods.">Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2(-Delta Delta C(T)) methods.</a> Methods. 25, 402-408 (2001).</li></ol>

הפרוטוקול המובא כאן הוא אופטימיזציה עבור בידוד וטיהור של נוירונים הפריפריה אשר להיצמד בחוזקה לפני השטח הפנימי של לציפורן third תסיסנית הזחל instar באמצעות מיון מגנטי חרוז אסטרטגיה התא. אמנם יש לנו להשתמש בפרוטוקול זה במיוחד כדי לבודד תסיסנית נוירונים דה, יישומים של פרוט?...

ציוד <ul style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> (10) לחסום מגנטים נאודימיום (K &amp; J מגנטיות, Inc, חתול. # B444B), לחילופין DynaMag ™ -2 (Invitrogen, חתול. # 123-21D) עשוי לשמש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> רקמות Kontes מלתעה זכוכית, 2 מ&quot;ל כושר עבודה, עם העלי סיקול גדולה (קט # 885300-0002) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תא מסננים, למשל MACS טרום ההפרדה סינון (Miltenyi BIOTEC, חתול. # 130-041-407) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 35 מ&quot;מ צלחות פטרי, מצופה Sylgard (Dow Corning Corporation, חתול. # 3097358-1004) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כלים לנתח: שני זוגות של דומון מס &#39;5 מלקחיים (כלים מדע טוב, חתול # 11251-20). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Vannas באביב מיקרו לנתיחה מספריים (כלים מדע טוב, חתול. # 15000-08) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Pipettes (P-1000, P-100, P-10) עם טיפים חד פעמיות </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Hemocytometer רגילה לספור את התאים טוהר אומדן </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Pipettes פסטר עם טיפים אש מלוטשת בקוטר סטנדרטי, צמצמה ל 50% ~ בקוטר סטנדרטי צמצמה ל 25% ~ בקוטר סטנדרטי טחינה דקה </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לוח צנטריפוגות מיקרו העליון (1-16,000 (x) ז) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מערבולת </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פלורסנט סטריאו מיקרוסקופ (א MZ16FA לייקה נעשה שימוש בפרוטוקול זה) </li></ul>

isolation and purification of drosophila peripheral neurons by magnetic bead sorting

<em&gt; תסיסנית</em&gt; מערכת העצבים ההיקפית (PNS) הוא מודל רב עוצמה עבור חוקרת את התהליכים המורכבים של פיתוח עצב המורפוגנזה דנדריט ברמות פונקציונלי מולקולרית. כדי לסייע בניתוחים אלה, פיתחנו אסטרטגיה לבידודה של subclass של נוירונים PNS נקרא arborization הדנדריטים (דה) נוירונים היה בשימוש נרחב לחקר המורפוגנזה דנדריט<sup&gt; 1,2</sup&gt;. נוירונים אלה קשה מאוד לבודד כאוכלוסייה טהור, בין השאר כתוצאה המופע שלהם נמוך ביותר שלהם, קשה להשגה מיקום מתחת לציפורן קשה הזחל כיטיניות. השיטה החדשה שפותחה שלנו מתגבר על אתגרים אלה, והיא מבוססת על העשרת תא מהיר באמצעות נוגדן ספציפי מצופה חרוזים מגנטיים. עבור מחקרים מגנטי שלנו מיון חרוז, השתמשנו בגיל בהתאמה third הזחלים instar להביע עכבר CD8 מתויג היתוך חלבון ה-GFP (<em&gt; כטב&quot;מ-mCD8-GFP</em&gt;)<sup&gt; 3</sup&gt; תחת שליטה של ​​אחת arborization הדנדריטי בכיתה IV (דה) נוירון ספציפי<em&gt; כייס (פ.פ.ק.)-GAL4</em&gt; הנהג<sup&gt; 4</sup&gt; או את השליטה GAL4 נוירון ספציפי פאן דה<sup&gt; 21-7</sup&gt; הנהג<sup&gt; 5</sup&gt;. אמנם זה פרוטוקול כבר מותאם לבידוד PNS תאים אשר מחוברים לקיר הפנימי של לציפורן הזחל, על ידי שינוי כמה פרמטרים, פרוטוקול אותו יכול לשמש כדי לבודד הרבה סוגי תאים שונים המחוברים לציפורן בשלבי הזחל או גלמי של פיתוח (למשל epithelia, שרירים, oenocytes וכו &#39;), או סוגי תאים אחרים מאיברים הזחל תלוי דפוס GAL4 ספציפיים ביטוי הנהג. RNA בודד בשיטה זו היא באיכות גבוהה והוא יכול לשמש בקלות עבור ניתוחים גנומית במורד כגון הביטוי microarray מחקרים פרופיל גנטי. גישה זו מציעה כלי חדש רב עוצמה לבצע מחקרים על מבודד<em&gt; תסיסנית</em&gt; הדנדריטים (דה) arborization נוירונים ובכך לספק תובנות הרומן לתוך המנגנונים המולקולריים שבבסיס המורפוגנזה דנדריט.

Watch this Scientific Journal Video about Isolation and Purification of Drosophila Peripheral Neurons by Magnetic Bead Sorting at JoVE.com

Isolation and Purification of Drosophila Peripheral Neurons by Magnetic Bead Sorting

במאמר וידאו זה אנו מציגים שיטה בידוד וטיהור של<em&gt; תסיסנית</em&gt; הנוירונים ההיקפיים באמצעות מיון מהיר מגנטי חרוז בסיוע אסטרטגיה התא. RNA המתקבלים בתאים מבודדים יכול לשמש בקלות עבור יישומים במורד הזרם כולל ניתוחים microarray.

בידוד טיהור תסיסנית נוירונים היקפיים על ידי מיון ביד מגנטי

The Drosophila peripheral nervous system (PNS) is a powerful model for investigating the complex processes of neuronal development and dendrite ...

Research

JoVE Journal

Biology

Isolation and Purification of Drosophila Peripheral Neurons by Magnetic Bead Sorting

Staining of Proteins in Gels with Coomassie G-250 without Organic Solvent and Acetic Acid

הכתמה של חלבונים עם ג&#39;ל Coomassie G-250 ללא חומצה אצטית ממס אורגני

In classical protein staining protocols using Coomassie Brilliant Blue (CBB), solutions with high contents of toxic and flammable organic solvents ...

Isolation of Labile Multi-protein Complexes by in vivo Controlled Cellular Cross-Linking and Immuno-magnetic Affinity Chromatography

Isolation of Labile Multi-protein Complexes by in vivo Controlled Cellular Cross-Linking and Immuno-magnetic Affinity Chromatography

בידוד יציב Multi-חלבון על ידי תסביכים In vivo מבוקר נייד חוצה קישור חיסונית מגנטי כרומטוגרפיה זיקה

The dynamic nature of cellular machineries is frequently built on transient and/or weak protein associations. These low affinity interactions preclude ...

Isolation of Drosophila melanogaster Testes

Isolation of Drosophila melanogaster Testes

בידוד תסיסנית melanogaster האשכים

The testes of Drosophila melanogaster provide an important model for the study of stem cell maintenance and differentiation, meiosis, and soma-germline ...

Isolation and Purification of Kinesin from Drosophila Embryos

Isolation and Purification of Kinesin from Drosophila Embryos

בידוד וטיהור של kinesin מ תסיסנית עוברים

Motor proteins move cargos along microtubules, and transport them to specific sub-cellular locations. Because altered transport is suggested to underlie a ...

Chromatin Isolation by RNA Purification (ChIRP)

Chromatin Isolation by RNA Purification ChIRP

בידוד הכרומטין על ידי טיהור RNA (ציוץ)

Long noncoding RNAs are key regulators of chromatin states for important biological processes such as dosage compensation, imprinting, and developmental ...

Isolation of Normal and Cancer-associated Fibroblasts from Fresh Tissues by Fluorescence Activated Cell Sorting (FACS)

Isolation of Normal and Cancer-associated Fibroblasts from Fresh Tissues by Fluorescence Activated Cell Sorting FACS

בידוד של פיברובלסטים נורמלים והסרטן הקשורים מרקמות טריות על ידי מיון תא הופעל פלואורסצנטי (FACS)

Cancer-associated fibroblasts (CAFs) are the most prominent cell type within the tumor stroma of many cancers, in particular breast carcinoma, and their ...

Purification of Transcripts and Metabolites from Drosophila Heads

Purification of Transcripts and Metabolites from Drosophila Heads

טיהור של תמלילים ומטבוליטים מ<em&gt; דרוזופילה</em&gt; ראשים

For the last decade, we have tried to understand the molecular and cellular mechanisms of neuronal degeneration using Drosophila as a model organism. ...

Organelle Transport in Cultured Drosophila Cells: S2 Cell Line and Primary Neurons.

Organelle Transport in Cultured Drosophila Cells: S2 Cell Line and Primary Neurons.

אברון תחבורה בתרבית<em&gt; דרוזופילה</em&gt; תאים: תא קו S2 ויסודי נוירונים.

Drosophila S2 cells plated on a coverslip in the presence of any actin-depolymerizing drug form long unbranched processes filled with uniformly polarized ...

Identifying Protein-protein Interaction in Drosophila Adult Heads by Tandem Affinity Purification (TAP)

Identifying Protein-protein Interaction in Drosophila Adult Heads by Tandem Affinity Purification TAP

זיהוי אינטראקציה בין חלבונים ב<em&gt; דרוזופילה</em&gt; ראשי מבוגרים טנדם זיקה טיהור (TAP)

Genetic screens conducted using Drosophila melanogaster (fruit fly) have made numerous milestone discoveries in the advance of biological sciences. ...

Rapid Isolation And Purification Of Mitochondria For Transplantation By Tissue Dissociation And Differential Filtration

בידוד מהיר וטיהור של מיטוכונדריה להשתלה על ידי דיסוציאציה רקמות ודיפרנציאל סינון

Previously described mitochondrial isolation methods using differential centrifugation and/or Ficoll gradient centrifugation require 60 to 100 min to ...