Name: isolation and purification of drosophila peripheral neurons by magnetic bead sorting
Uploaded: 2009-12-01T14:59:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolation and Purification of Drosophila Peripheral Neurons by Magnetic Bead Sorting at JoVE.com

Agradecemos a drs. Yuh-Nung Jan e Wes Grueber para a prestação de stocks voar utilizados neste estudo. Os autores agradecem o F. Thomas e Kate Miller Jeffress Memorial Trust para o apoio desta pesquisa (DNC) e do Gabinete do Reitor da Universidade George Mason da (EPRI).

Comentários gerais sobre classificação Bead Magnética de Neurônios Drosophila periférica (tempo total para a Conclusão do Protocolo: 2,5-3 horas) Procedimentos de laboratório padrão para manter um ambiente limpo e livre de RNAse devem ser observados em todos os momentos para prevenir a degradação do RNA. Quando a Drosophila cutícula larval é dissecada e colocada no buffer de células dissociação, os neurônios periféricos são um...

<ol>
	<li>Corty, M. M., Matthews, B. J., Grueber, W. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecules+and+mechanisms+of+dendrite+development+in+Drosophila.">Molecules and mechanisms of dendrite development in Drosophila.</a> Development. 136, 1049-1061 (2009).</li><li>Parrish, J. Z., Emoto, K., Kim, ., Jan, Y. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+that+regulate+establishment,+maintenance,+and+remodeling+of+dendritic+fields.">Mechanisms that regulate establishment, maintenance, and remodeling of dendritic fields.</a> Ann. Rev. Neurosci. 30, 399-423 (2007).</li><li>Lee, T., Luo, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mosaic+analysis+with+a+repressible+cell+marker+for+studies+of+gene+function+in+neuronal+morphogenesis.">Mosaic analysis with a repressible cell marker for studies of gene function in neuronal morphogenesis.</a> Neuron. 22, 451-461 (1999).</li><li>Grueber, W. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Projections+of+Drosophila+multidendritic+neurons+in+the+central+nervous+system:+links+with+peripheral+dendrite+morphology.">Projections of Drosophila multidendritic neurons in the central nervous system: links with peripheral dendrite morphology.</a> Development. 134, 55-64 (2007).</li><li>Song, W., Onishi, M., Jan, L. Y., Jan, Y. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Peripheral+multidendritic+sensory+neurons+are+necessary+for+rhythmic+locomotion+behavior+in+Drosophila+larvae.">Peripheral multidendritic sensory neurons are necessary for rhythmic locomotion behavior in Drosophila larvae.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 104, 5199-5204 (2007).</li><li>Livak, K. J., Schmittgen, T. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+relative+gene+expression+data+using+real-time+quantitative+PCR+and+the+2(-Delta+Delta+C(T))+methods.">Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2(-Delta Delta C(T)) methods.</a> Methods. 25, 402-408 (2001).</li></ol>

O protocolo aqui apresentado é otimizado para o isolamento e purificação de neurônios periféricos que aderem firmemente à superfície interna do estádio terceiro Drosophila cutícula larval usando uma estratégia de triagem magnética talão celular. Embora tenhamos utilizado este protocolo especificamente para isolar neurônios da Drosophila, aplicações deste protocolo para o isolamento de outros tipos de células que se aderem à cutícula larval ou na fase de pupa de desenvolvimento (por exemplo, epitélios,...

Equipamento <ul><li> (10) ímãs de neodímio bloco (K &amp; J Magnetics, Inc., Cat. # B444B), alternativamente DynaMag ™ -2 (Invitrogen, Cat. # 123-21D) podem ser usados. </li><li> Kontes Grinder tecido de vidro, 2 ml de capacidade de trabalho, com pilão grande folga (Cat. # 885300-0002) </li><li> Filtros de celular, por exemplo, MACS Pré-Separação Filter (Miltenyi Biotec, Cat. # 130-041-407) </li><li> 35 milímetros petri pratos revestido com Sylgard (Dow Corning Corporation, Cat. # 3097358-1004) </li><li> Ferramentas de dissecação: dois pares de fórceps Dumont n º 5 (Ferramentas Ciência Fine, Cat # 11251-20). </li><li> Vannas primavera micro-tesoura de dissecção (Ferramentas Ciência Fine, Cat. # 15000-08) </li><li> Pipetas (P-1000, P-100, P-10) com pontas </li><li> Hemocitômetro padrão para contar as células e pureza estimativa </li><li> Pipetas Pasteur com pontas de fogo polido de diâmetro padrão, diminuiu para ~ 50% do diâmetro normal e reduzido para ~ 25% do diâmetro padrão para trituração </li><li> Tabela centrífuga micro-top (1-16,000 (x) g) </li><li> Vórtice </li><li> Fluorescentes estereomicroscópio (a MZ16FA Leica foi usado neste protocolo) </li></ul>

isolation and purification of drosophila peripheral neurons by magnetic bead sorting

O<em&gt; Drosophila</em&gt; Sistema nervoso periférico (PNS) é um poderoso modelo para investigar os processos complexos de desenvolvimento neuronal e morfogênese dendrite a nível funcional e molecular. Para auxiliar nestas análises, temos desenvolvido uma estratégia para o isolamento de uma subclasse de neurônios chamado PNS arborização dendrítica (da) neurônios que têm sido amplamente utilizados para estudar a morfogênese dendrite<sup&gt; 1,2</sup&gt;. Esses neurônios são muito difíceis de isolar como uma população pura, em parte devido à sua ocorrência extremamente baixa e sua difícil de alcançar localização abaixo da cutícula quitinosa resistente larval. Nosso método recém-desenvolvido supera estes desafios, e é baseado em uma célula de enriquecimento rápido e específico utilizando anticorpos revestido esferas magnéticas. Para os nossos estudos de triagem magnética talão, temos utilizado pareados por idade larvas de terceiro estádio expressar um rato CD8 proteína de fusão com a tag GFP (<em&gt; UAS-mCD8-GFP</em&gt;)<sup&gt; 3</sup&gt; Sob o controle tanto da arborização dendrítica classe IV (da) neurônio-específica<em&gt; Pickpocket (PPK)-GAL4</em&gt; Driver<sup&gt; 4</sup&gt; Ou o controle da pan-da GAL4 neurônio-específica<sup&gt; 21-7</sup&gt; Driver<sup&gt; 5</sup&gt;. Embora este protocolo foi optimizado para isolar PNS células que estão ligados à parede interna da cutícula larval, variando alguns parâmetros, o mesmo protocolo pode ser usado para isolar muitos tipos de células diferentes ligados à cutícula nas fases larval e pupal de desenvolvimento (por exemplo, epitélios, músculo, oenocytes etc), ou outros tipos de células de órgãos larval, dependendo do padrão de expressão GAL4 driver específico. O RNA isolada por este método é de alta qualidade e pode ser facilmente usado para jusante análises genômicas, tais como gene microarray estudos de perfil de expressão. Esta abordagem oferece uma nova e poderosa ferramenta para realizar estudos sobre isolado<em&gt; Drosophila</em&gt; Dendríticas arborização (da) neurônios proporcionando conhecimentos novos sobre os mecanismos moleculares subjacentes à morfogênese dendrite.

Watch this Scientific Journal Video about Isolation and Purification of Drosophila Peripheral Neurons by Magnetic Bead Sorting at JoVE.com

Isolation and Purification of Drosophila Peripheral Neurons by Magnetic Bead Sorting

Neste vídeo-artigo apresentamos um método para o isolamento e purificação de<em&gt; Drosophila</em&gt; Neurônios periféricos usando um jejum magnética estratégia de triagem talão assistida celular. RNA obtido a partir de células isoladas podem ser facilmente usados ​​para aplicações a jusante, incluindo análises microarray.

Isolamento e purificação de Drosophila Neurônios periféricos por classificação Bead Magnética

The Drosophila peripheral nervous system (PNS) is a powerful model for investigating the complex processes of neuronal development and dendrite ...

Research

JoVE Journal

Biology

Isolation and Purification of Drosophila Peripheral Neurons by Magnetic Bead Sorting

Staining of Proteins in Gels with Coomassie G-250 without Organic Solvent and Acetic Acid

Coloração de proteínas em géis com Coomassie G-250 sem ácido acético e Solventes Orgânicos

In classical protein staining protocols using Coomassie Brilliant Blue (CBB), solutions with high contents of toxic and flammable organic solvents ...

Biologia

Isolation of Labile Multi-protein Complexes by in vivo Controlled Cellular Cross-Linking and Immuno-magnetic Affinity Chromatography

Isolation of Labile Multi-protein Complexes by in vivo Controlled Cellular Cross-Linking and Immuno-magnetic Affinity Chromatography

Isolamento de proteínas lábeis Multi-Complexos por In vivo Controlled Cellular Cross-Linking and Imuno-magnética cromatografia de afinidade

The dynamic nature of cellular machineries is frequently built on transient and/or weak protein associations. These low affinity interactions preclude ...

Isolation of Drosophila melanogaster Testes

Isolation of Drosophila melanogaster Testes

Isolamento de Drosophila melanogaster Testes

The testes of Drosophila melanogaster provide an important model for the study of stem cell maintenance and differentiation, meiosis, and soma-germline ...

Isolation and Purification of Kinesin from Drosophila Embryos

Isolation and Purification of Kinesin from Drosophila Embryos

Isolamento e Purificação de cinesina partir Drosophila Os embriões

Motor proteins move cargos along microtubules, and transport them to specific sub-cellular locations. Because altered transport is suggested to underlie a ...

Chromatin Isolation by RNA Purification (ChIRP)

Chromatin Isolation by RNA Purification ChIRP

Isolamento de cromatina por purificação de RNA (CHIRP)

Long noncoding RNAs are key regulators of chromatin states for important biological processes such as dosage compensation, imprinting, and developmental ...

Isolation of Normal and Cancer-associated Fibroblasts from Fresh Tissues by Fluorescence Activated Cell Sorting (FACS)

Isolation of Normal and Cancer-associated Fibroblasts from Fresh Tissues by Fluorescence Activated Cell Sorting FACS

Isolamento de fibroblastos normais e associados ao câncer de tecidos frescos, classificando células activadas por fluorescência (FACS)

Cancer-associated fibroblasts (CAFs) are the most prominent cell type within the tumor stroma of many cancers, in particular breast carcinoma, and their ...

Purification of Transcripts and Metabolites from Drosophila Heads

Purification of Transcripts and Metabolites from Drosophila Heads

Purificação de Transcrições e metabolitos de<em&gt; Drosophila</em&gt; Cabeças

For the last decade, we have tried to understand the molecular and cellular mechanisms of neuronal degeneration using Drosophila as a model organism. ...

Organelle Transport in Cultured Drosophila Cells: S2 Cell Line and Primary Neurons.

Organelle Transport in Cultured Drosophila Cells: S2 Cell Line and Primary Neurons.

Transporte Organelle em Cultivadas<em&gt; Drosophila</em&gt; Células: Linha celular S2 e primário neurônios.

Drosophila S2 cells plated on a coverslip in the presence of any actin-depolymerizing drug form long unbranched processes filled with uniformly polarized ...

Identifying Protein-protein Interaction in Drosophila Adult Heads by Tandem Affinity Purification (TAP)

Identifying Protein-protein Interaction in Drosophila Adult Heads by Tandem Affinity Purification TAP

Identificando interacção proteína-proteína em<em&gt; Drosophila</em&gt; Chefes Adulto por Tandem Affinity Purification (TAP)

Genetic screens conducted using Drosophila melanogaster (fruit fly) have made numerous milestone discoveries in the advance of biological sciences. ...

Rapid Isolation And Purification Of Mitochondria For Transplantation By Tissue Dissociation And Differential Filtration

Rápido isolamento e purificação de mitocôndrias para o transplante pela dissociação do tecido e Filtração Diferencial

Previously described mitochondrial isolation methods using differential centrifugation and/or Ficoll gradient centrifugation require 60 to 100 min to ...