Name: isolation and purification of drosophila peripheral neurons by magnetic bead sorting
Uploaded: 2009-12-01T14:59:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolation and Purification of Drosophila Peripheral Neurons by Magnetic Bead Sorting at JoVE.com

Agradecemos a los Dres. Yuh-Nung Jan y Grueber Wes para proporcionar poblaciones de moscas utilizadas en este estudio. Los autores agradecen la F. Thomas y Kate Miller Jeffress Memorial Trust para el apoyo de esta investigación (DNC) y la Oficina de la Universidad George Mason Provost (EPRI).

Comentarios generales sobre clasificación magnética de bolas de Drosophila neuronas periféricas (El tiempo total para la conclusión del Protocolo: 2.5-3 horas) Procedimientos estándar de laboratorio para el mantenimiento de un medio ambiente limpio, libre de ARNasa deben ser observadas en todo momento para evitar la degradación del ARN. Cuando la cutícula larval de Drosophila se diseca y se coloca en el buffer de disociación celular, las...

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	<li>Corty, M. M., Matthews, B. J., Grueber, W. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecules+and+mechanisms+of+dendrite+development+in+Drosophila.">Molecules and mechanisms of dendrite development in Drosophila.</a> Development. 136, 1049-1061 (2009).</li><li>Parrish, J. Z., Emoto, K., Kim, ., Jan, Y. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+that+regulate+establishment,+maintenance,+and+remodeling+of+dendritic+fields.">Mechanisms that regulate establishment, maintenance, and remodeling of dendritic fields.</a> Ann. Rev. Neurosci. 30, 399-423 (2007).</li><li>Lee, T., Luo, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mosaic+analysis+with+a+repressible+cell+marker+for+studies+of+gene+function+in+neuronal+morphogenesis.">Mosaic analysis with a repressible cell marker for studies of gene function in neuronal morphogenesis.</a> Neuron. 22, 451-461 (1999).</li><li>Grueber, W. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Projections+of+Drosophila+multidendritic+neurons+in+the+central+nervous+system:+links+with+peripheral+dendrite+morphology.">Projections of Drosophila multidendritic neurons in the central nervous system: links with peripheral dendrite morphology.</a> Development. 134, 55-64 (2007).</li><li>Song, W., Onishi, M., Jan, L. Y., Jan, Y. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Peripheral+multidendritic+sensory+neurons+are+necessary+for+rhythmic+locomotion+behavior+in+Drosophila+larvae.">Peripheral multidendritic sensory neurons are necessary for rhythmic locomotion behavior in Drosophila larvae.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 104, 5199-5204 (2007).</li><li>Livak, K. J., Schmittgen, T. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+relative+gene+expression+data+using+real-time+quantitative+PCR+and+the+2(-Delta+Delta+C(T))+methods.">Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2(-Delta Delta C(T)) methods.</a> Methods. 25, 402-408 (2001).</li></ol>

El protocolo que aquí se presenta ha sido optimizado para el aislamiento y purificación de las neuronas periféricas, que se adhieren firmemente a la superficie interna de la Drosophila cutícula tercer estadio larval con un cordón magnético de la estrategia de clasificación de células. A pesar de que han utilizado este protocolo para aislar específicamente Drosophila neuronas da, la aplicación de este protocolo para el aislamiento de otros tipos de células que se adhieren a la cutícula de las larvas o pupas d...

Equipo <ul><li> (10) imanes de neodimio de bloque (K &amp; J Magnetics, Inc., cat. # B444B), en su defecto dynamag ™ 2 (Invitrogen, cat. # 123-21D) puede ser utilizado. </li><li> Glass Kontes tejido Grinder, 2 ml de capacidad de trabajo, con su correspondiente mano gran distancia (Cat. # 885300-0.002) </li><li> Filtros de la célula, por ejemplo, MACS Pre-filtro de separación (Miltenyi Biotec, cat. # 130-041-407) </li><li> 35 mm placas petri cubiertas con Sylgard (Dow Corning Corporation, cat. # 3097358 a 1.004) </li><li> Herramientas de disección: dos pares de pinzas Dumont N º 5 (Herramientas Artes Ciencia, Cat # 11251-20). </li><li> Vannas primavera microdisección tijeras (Herramientas Artes Ciencia, cat. # 15000 a 08) </li><li> Pipetas (P-1000, P-100, P-10) con puntas desechables </li><li> Hemocitómetro estándar para contar las células y la pureza de estimación </li><li> Pipetas Pasteur con puntas pulidas al fuego de diámetro estándar, se redujo a aproximadamente el 50% del diámetro normal y reducido a ~ 25% del diámetro estándar para la trituración </li><li> Para la mesa de microcentrífuga (1-16,000 (x) g) </li><li> Vórtice </li><li> Fluorescentes estereomicroscopio (a MZ16FA Leica fue utilizada en este protocolo) </li></ul>

isolation and purification of drosophila peripheral neurons by magnetic bead sorting

La<em&gt; Drosophila</em&gt; Del sistema nervioso periférico (SNP) es un poderoso modelo para la investigación de los complejos procesos de desarrollo neuronal y la morfogénesis de las dendritas a nivel funcional y molecular. Para ayudar en estos análisis, hemos desarrollado una estrategia para el aislamiento de una subclase de las neuronas PNS llamada arborización dendrítica (da), las neuronas que han sido ampliamente utilizados para el estudio de la morfogénesis dendrita<sup&gt; 1,2</sup&gt;. Estas neuronas son muy difíciles de aislar en una población pura, debido en parte a su ocurrencia muy baja y su-difícil de alcanzar ubicación por debajo de la cutícula larval dura de quitina. Nuestro nuevo método supera estos desafíos, y se basa en una celda de enriquecimiento rápido y específico mediante anticuerpos recubiertos con partículas magnéticas. Para nuestros estudios magnéticos clasificación de cuentas, hemos utilizado la misma edad larvas de tercer estadio que expresa una proteína del ratón CD8 etiquetado de fusión GFP (<em&gt; UAS-GFP-mCD8</em&gt;)<sup&gt; 3</sup&gt; Bajo el control de cualquiera de la arborización dendrítica de clase IV (da) neuronal específica<em&gt; Carterista (PPK)-GAL4</em&gt; Conductor<sup&gt; 4</sup&gt; O el control de la pan-da neuronal específica GAL4<sup&gt; 21-7</sup&gt; Conductor<sup&gt; 5</sup&gt;. Aunque este protocolo ha sido optimizado para aislar las células PNS que se unen a la pared interna de la cutícula de las larvas, mediante la variación de algunos parámetros, el mismo protocolo que podría ser utilizado para aislar diferentes tipos de células adjunta a la cutícula en las etapas de larva o pupa desarrollo (por ejemplo, epitelios, muscular, etc oenocytes), u otros tipos de células de los órganos de las larvas dependiendo del modelo de driver GAL4 expresión específica. El ARN aislado por este método es de alta calidad y puede ser fácilmente utilizada para posteriores análisis genómico, tales como estudios de microarrays perfiles de expresión génica. Este enfoque ofrece una nueva y poderosa herramienta para llevar a cabo estudios sobre el aislamiento<em&gt; Drosophila</em&gt; Arborización dendrítica (da), las neuronas lo que proporciona nuevos conocimientos sobre los mecanismos moleculares subyacentes a la morfogénesis de dendritas.

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Isolation and Purification of Drosophila Peripheral Neurons by Magnetic Bead Sorting

En este video-artículo se presenta un método para el aislamiento y purificación de<em&gt; Drosophila</em&gt; Neuronas periféricas con una rápida estrategia de asistencia con bolas magnéticas clasificación de células. ARN obtenido a partir de las células aisladas pueden ser fácilmente utilizada para aplicaciones posteriores incluyendo el análisis de microarrays.

Aislamiento y purificación de Drosophila Clasificación de las neuronas periféricas por bolas magnéticas

The Drosophila peripheral nervous system (PNS) is a powerful model for investigating the complex processes of neuronal development and dendrite ...

Research

JoVE Journal

Biology

Isolation and Purification of Drosophila Peripheral Neurons by Magnetic Bead Sorting

Staining of Proteins in Gels with Coomassie G-250 without Organic Solvent and Acetic Acid

Tinción de las proteínas en geles con Coomassie G-250, sin ácido disolvente orgánico y el acético

In classical protein staining protocols using Coomassie Brilliant Blue (CBB), solutions with high contents of toxic and flammable organic solvents ...

Investigación

Biología

Isolation of Labile Multi-protein Complexes by in vivo Controlled Cellular Cross-Linking and Immuno-magnetic Affinity Chromatography

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El aislamiento de lábil Multi-complejos de proteínas por In vivo Control Celular entrecruzamiento y Inmuno-cromatografía de afinidad magnética

The dynamic nature of cellular machineries is frequently built on transient and/or weak protein associations. These low affinity interactions preclude ...

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El aislamiento de Drosophila melanogaster Testículos

The testes of Drosophila melanogaster provide an important model for the study of stem cell maintenance and differentiation, meiosis, and soma-germline ...

Isolation and Purification of Kinesin from Drosophila Embryos

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Aislamiento y purificación de Kinesin desde Drosophila Los embriones

Motor proteins move cargos along microtubules, and transport them to specific sub-cellular locations. Because altered transport is suggested to underlie a ...

Chromatin Isolation by RNA Purification (ChIRP)

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Aislamiento de la cromatina mediante la purificación de ARN (chirp)

Long noncoding RNAs are key regulators of chromatin states for important biological processes such as dosage compensation, imprinting, and developmental ...

Isolation of Normal and Cancer-associated Fibroblasts from Fresh Tissues by Fluorescence Activated Cell Sorting (FACS)

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Aislamiento de fibroblastos normales y el cáncer asociado-de los tejidos frescos por Clasificación células activadas por fluorescencia (FACS)

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Purification of Transcripts and Metabolites from Drosophila Heads

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Purificación de las transcripciones y los metabolitos de<em&gt; Drosophila</em&gt; Cabezales

For the last decade, we have tried to understand the molecular and cellular mechanisms of neuronal degeneration using Drosophila as a model organism. ...

Organelle Transport in Cultured Drosophila Cells: S2 Cell Line and Primary Neurons.

Organelle Transport in Cultured Drosophila Cells: S2 Cell Line and Primary Neurons.

Orgánulos Transporte en Cultivadas<em&gt; Drosophila</em&gt; Celdas: S2 Línea Celular y neuronas primarias.

Drosophila S2 cells plated on a coverslip in the presence of any actin-depolymerizing drug form long unbranched processes filled with uniformly polarized ...

Identifying Protein-protein Interaction in Drosophila Adult Heads by Tandem Affinity Purification (TAP)

Identifying Protein-protein Interaction in Drosophila Adult Heads by Tandem Affinity Purification TAP

La identificación de la interacción proteína-proteína en<em&gt; Drosophila</em&gt; Jefes adultas por Tandem Affinity purificación (TAP)

Genetic screens conducted using Drosophila melanogaster (fruit fly) have made numerous milestone discoveries in the advance of biological sciences. ...

Rapid Isolation And Purification Of Mitochondria For Transplantation By Tissue Dissociation And Differential Filtration

Aislamiento rápido y purificación de mitocondrias para el trasplante por disociación de tejidos y filtración diferencial

Previously described mitochondrial isolation methods using differential centrifugation and/or Ficoll gradient centrifugation require 60 to 100 min to ...