Name: isolation and purification of drosophila peripheral neurons by magnetic bead sorting
Uploaded: 2009-12-01T14:59:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolation and Purification of Drosophila Peripheral Neurons by Magnetic Bead Sorting at JoVE.com

Vi tackar Dr. Yuh-nung Jan och Wes Grueber för att ge flugan lager som används i denna studie. Författarna erkänner Thomas F. och Kate Miller Jeffress Memorial Trust för att stödja denna forskning (DNC) och George Mason University Provost kontor (EPRI).

Allmänna kommentarer om Magnetic Bead Sortering av Drosophila neuron (Totalt Tidpunkt för genomförandet av protokollet: 2,5-3 timmar) Standard lab rutiner för att upprätthålla en ren, RNAse fri miljö måste iakttas vid alla tillfällen för att förhindra RNA nedbrytning. När Drosophila larver nagelband är dissekeras och placeras i cellen dissociation buffert, det perifera nervceller är en av de sista cellerna att lossna från nagelban...

<ol>
	<li>Corty, M. M., Matthews, B. J., Grueber, W. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecules+and+mechanisms+of+dendrite+development+in+Drosophila.">Molecules and mechanisms of dendrite development in Drosophila.</a> Development. 136, 1049-1061 (2009).</li><li>Parrish, J. Z., Emoto, K., Kim, ., Jan, Y. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+that+regulate+establishment,+maintenance,+and+remodeling+of+dendritic+fields.">Mechanisms that regulate establishment, maintenance, and remodeling of dendritic fields.</a> Ann. Rev. Neurosci. 30, 399-423 (2007).</li><li>Lee, T., Luo, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mosaic+analysis+with+a+repressible+cell+marker+for+studies+of+gene+function+in+neuronal+morphogenesis.">Mosaic analysis with a repressible cell marker for studies of gene function in neuronal morphogenesis.</a> Neuron. 22, 451-461 (1999).</li><li>Grueber, W. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Projections+of+Drosophila+multidendritic+neurons+in+the+central+nervous+system:+links+with+peripheral+dendrite+morphology.">Projections of Drosophila multidendritic neurons in the central nervous system: links with peripheral dendrite morphology.</a> Development. 134, 55-64 (2007).</li><li>Song, W., Onishi, M., Jan, L. Y., Jan, Y. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Peripheral+multidendritic+sensory+neurons+are+necessary+for+rhythmic+locomotion+behavior+in+Drosophila+larvae.">Peripheral multidendritic sensory neurons are necessary for rhythmic locomotion behavior in Drosophila larvae.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 104, 5199-5204 (2007).</li><li>Livak, K. J., Schmittgen, T. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+relative+gene+expression+data+using+real-time+quantitative+PCR+and+the+2(-Delta+Delta+C(T))+methods.">Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2(-Delta Delta C(T)) methods.</a> Methods. 25, 402-408 (2001).</li></ol>

Protokollet presenteras här är optimerad för isolering och rening av perifera nervceller som följer tätt på insidan av Drosophila third INSTAR larver nagelband hjälp av en magnetisk kula strategi cell sortering. Samtidigt som vi har använt detta protokoll för att specifikt isolera Drosophila da nervceller, tillämpningar av detta protokoll till isolering av andra celltyper som följer på nagelbanden i larver eller PUPP-utvecklingsstadier (t.ex. epitel, muskel, andra perifera nervceller) kan anpassas av variera...

Utrustning <ul><li> (10) Neodymium blockera magneter (K ​​&amp; J Magnetics, Inc., Cat. # B444B), alternativt DynaMag ™ -2 (Invitrogen, Kat. # 123-21D) får användas. </li><li> Kontes glasfilt Grinder, 2 ml arbetsförmåga, med stora clearance mortelstöt (kat. # 885.300-0002) </li><li> Cell filter, t.ex. MACS försepareringen Filter (Miltenyi Biotec, Cat. # 130-041-407) </li><li> 35 mm Petri-rätter belagda med Sylgard (Dow Corning Corporation, Cat. # 3.097.358-1004) </li><li> Analysera verktyg: två par Dumont nr 5 pincett (Fine Science Tools, Cat # 11.251-20.) </li><li> Vannas våren mikro-dissektion sax (Fine Science Tools, Cat. # 15.000-08) </li><li> Pipetter (P-1000, P-100, P-10) med engångsspetsar </li><li> Standard hemocytometer för att räkna celler och uppskattning renhet </li><li> Pasteur pipetter med eld polerade tips av standard diameter, minskade till ~ 50% av standard diameter och krympt till ~ 25% av standard diameter för trituration </li><li> Bordsskiva mikro-centrifug (1-16,000 (x) g) </li><li> Vortex </li><li> Fluorescerande stereomikroskop (Leica MZ16FA användes i detta protokoll) </li></ul>

isolation and purification of drosophila peripheral neurons by magnetic bead sorting

Den<em&gt; Drosophila</em&gt; Perifera nervsystemet (PNS) är en kraftfull modell för att undersöka de komplexa processer av neuronala utveckling och Dendrite morfogenes på funktionell och molekylär nivå. För att underlätta dessa analyser har vi utvecklat en strategi för isolering av en underklass av PNS nervceller som kallas dendritiska arborization (DA) nervceller som har ofta använts för att studera Dendrite morfogenes<sup&gt; 1,2</sup&gt;. Dessa nervceller är mycket svårt att isolera som en ren befolkning, delvis på grund av sin extremt låga förekomst och deras svåra att nå plats under tuffa chitinous larver nagelband. Vår nyutvecklade metoden övervinner dessa utmaningar, och är baserad på en snabb och specifik cell berikning med antikroppsförsedda magnetiska kulor. För vår magnetiska sträng sortering studier har vi använt åldersmatchade third INSTAR larver som uttrycker en mus CD8 taggad GFP fusionsprotein (<em&gt; YH-mCD8-GFP</em&gt;)<sup&gt; 3</sup&gt; Under kontroll av antingen klass IV dendritiska arborization (DA) neuron-specifika<em&gt; Ficktjuv (PPK)-GAL4</em&gt; Förare<sup&gt; 4</sup&gt; Eller kontrollen av den pan-da neuron-specifika GAL4<sup&gt; 21-7</sup&gt; Förare<sup&gt; 5</sup&gt;. Även om detta protokoll har optimerats för att isolera PNS celler som är knutna till den inre väggen av larver nagelband, genom att ändra ett fåtal parametrar kan samma protokoll som används för att isolera många olika celltyper fäst vid nagelbanden på larver eller PUPP-stadier utveckling (t.ex. epitel, muskel, oenocytes etc.), eller andra typer cell från larver organ beroende på GAL4-specifika drivrutiner uttryck mönster. RNA isoleras av denna metod är av hög kvalitet och kan lätt användas för nedströms genomiska analyser såsom microarray profilering av genuttryck för studier. Denna metod erbjuder ett kraftfullt nytt verktyg för att utföra studier på isolerade<em&gt; Drosophila</em&gt; Dendritiska arborization (DA) nervceller vilket ger nya insikter i de molekylära mekanismerna bakom Dendrite morfogenes.

Watch this Scientific Journal Video about Isolation and Purification of Drosophila Peripheral Neurons by Magnetic Bead Sorting at JoVE.com

Isolation and Purification of Drosophila Peripheral Neurons by Magnetic Bead Sorting

I denna video-artikeln presenterar vi en metod för isolering och rening av<em&gt; Drosophila</em&gt; Perifera nervceller med hjälp av en snabb magnetiska pärla assisterad strategi cell sortering. RNA från de isolerade cellerna kan lätt användas för nedströms tillämpningar inklusive microarray analyser.

Isolering och rening av Drosophila Kringutrustning Nervceller av magnetiska Bead Sortering

The Drosophila peripheral nervous system (PNS) is a powerful model for investigating the complex processes of neuronal development and dendrite ...

Research

JoVE Journal

Biology

Isolation and Purification of Drosophila Peripheral Neurons by Magnetic Bead Sorting

Staining of Proteins in Gels with Coomassie G-250 without Organic Solvent and Acetic Acid

Färgning av proteinerna i geler med Coomassie G-250 utan organiska lösningsmedel och ättiksyra

In classical protein staining protocols using Coomassie Brilliant Blue (CBB), solutions with high contents of toxic and flammable organic solvents ...

Isolation of Labile Multi-protein Complexes by in vivo Controlled Cellular Cross-Linking and Immuno-magnetic Affinity Chromatography

Isolation of Labile Multi-protein Complexes by in vivo Controlled Cellular Cross-Linking and Immuno-magnetic Affinity Chromatography

Isolering av labil Multi-proteinkomplex av In vivo Kontrollerad Cellular tvärbindning och Immuno-magnetiska affinitetskromatografi

The dynamic nature of cellular machineries is frequently built on transient and/or weak protein associations. These low affinity interactions preclude ...

Isolation of Drosophila melanogaster Testes

Isolation of Drosophila melanogaster Testes

Isolering av Drosophila melanogaster Testiklar

The testes of Drosophila melanogaster provide an important model for the study of stem cell maintenance and differentiation, meiosis, and soma-germline ...

Isolation and Purification of Kinesin from Drosophila Embryos

Isolation and Purification of Kinesin from Drosophila Embryos

Isolering och rening av kinesin från Drosophila Embryon

Motor proteins move cargos along microtubules, and transport them to specific sub-cellular locations. Because altered transport is suggested to underlie a ...

Chromatin Isolation by RNA Purification (ChIRP)

Chromatin Isolation by RNA Purification ChIRP

Kromatin Isolering av RNA Rening (chirp)

Long noncoding RNAs are key regulators of chromatin states for important biological processes such as dosage compensation, imprinting, and developmental ...

Isolation of Normal and Cancer-associated Fibroblasts from Fresh Tissues by Fluorescence Activated Cell Sorting (FACS)

Isolation of Normal and Cancer-associated Fibroblasts from Fresh Tissues by Fluorescence Activated Cell Sorting FACS

Isolering av normala och cancer-associerade fibroblaster från färska vävnader genom fluorescensaktiverad cellsortering (FACS)

Cancer-associated fibroblasts (CAFs) are the most prominent cell type within the tumor stroma of many cancers, in particular breast carcinoma, and their ...

Purification of Transcripts and Metabolites from Drosophila Heads

Purification of Transcripts and Metabolites from Drosophila Heads

Rening av Transkript och metaboliter från<em&gt; Drosophila</em&gt; Heads

For the last decade, we have tried to understand the molecular and cellular mechanisms of neuronal degeneration using Drosophila as a model organism. ...

Organelle Transport in Cultured Drosophila Cells: S2 Cell Line and Primary Neurons.

Organelle Transport in Cultured Drosophila Cells: S2 Cell Line and Primary Neurons.

Organell Transport i Odlade<em&gt; Drosophila</em&gt; Celler: S2 cellinje och primär nervceller.

Drosophila S2 cells plated on a coverslip in the presence of any actin-depolymerizing drug form long unbranched processes filled with uniformly polarized ...

Identifying Protein-protein Interaction in Drosophila Adult Heads by Tandem Affinity Purification (TAP)

Identifying Protein-protein Interaction in Drosophila Adult Heads by Tandem Affinity Purification TAP

Identifiera protein-proteininteraktion i<em&gt; Drosophila</em&gt; Vuxen Heads av Tandem Affinity Purification (TAP)

Genetic screens conducted using Drosophila melanogaster (fruit fly) have made numerous milestone discoveries in the advance of biological sciences. ...

Rapid Isolation And Purification Of Mitochondria For Transplantation By Tissue Dissociation And Differential Filtration

Snabb Isolering och rening av Mitokondrier För Transplantation Av vävnadsdissociering Och Differential Filtration

Previously described mitochondrial isolation methods using differential centrifugation and/or Ficoll gradient centrifugation require 60 to 100 min to ...