Name: intranuclear microinjection of dna into dissociated adult mammalian neurons
Uploaded: 2009-12-10T17:10:00
Duration: 13 min 39 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Intranuclear Microinjection of DNA into Dissociated Adult Mammalian Neurons at JoVE.com

Ons laboratorium onderzoek wordt ondersteund door de Intramurale Research Program van de NIH, National Institute on Alcohol misbruik en alcoholisme.

<html> I. Voorbereiding voor injectie Deze sectie beschrijft de voorbereidende stappen die moeten vooraf worden genomen om te injecteren cDNA in de kern van neuronen. De isolatie procedure voor neuronen valt buiten het bestek van dit artikel, maar het is belangrijk om neuronen gescheiden in individuele cellen hebben en hechten goed aan de onderkant van 35 mm celkweek gerechten (zie Overleg voor nuttige tips om dit te bereiken). Hoewel een verscheidenheid van verschillende neuronen zou kunnen worden gebruikt, zijn perifere ganglia, zoals de superieure cervicale ganglia (SCG) of de achterwortelganglia voorkeur voor dissectie, omdat ze gemakkelijk toegankelijk zijn en de opbrengst van een groot aantal neuronen. Bijkomende voordelen van het gebruik van SCG neuronen zijn dat ze een relatief homogene populatie van cellen en goed gekarakteriseerde 1,2,3,4. A. Bereiding van plasmide cDNA voor injectie <ol><li> Om te voorkomen dat verontreiniging of afbraak van DNA, moeten handschoenen worden gedragen tijdens de voorbereiding. </li><li> DNA dat codeert voor het eiwit van belang is gesubkloneerd in een geschikte expressievector zoogdier, zoals PCI (Promega, Madison, WI), onder de regulering van de zeer en de constitutief actieve cytomegalovirus (CMV) promotor. Als het eiwit niet wordt gelabeld, een reporter plasmide, is codering EGFP bijvoorbeeld (pEGFP-N1, BD Biosciences Clontech, Palo Alto, CA), co-geïnjecteerd om succesvolle injectie en expressie te bevestigen. DNA wordt geïsoleerd met behulp van een hoge kwaliteit scheidingskolom (bijv. QIAfilter Midi-prep-kit, Qiagen, Chatsworth, CA) en verder gezuiverd met behulp van een centrifugale filter unit met een PVDF filter (0,1 urn, Millipore, Bedford, MA) om deeltjes te verwijderen in de plasmide voorbereiding, die injectie pipetten kunnen een belemmering vormen tijdens de injectie proces. Plasmiden worden bewaard bij -20 ° C bij een concentratie van ongeveer 1 ug / ul in een geschikte DNA opslagbuffer (bijv. TE-buffer: 10 mM Tris, 1 mM EDTA, pH 8,0). </li><li> Onmiddellijk voorafgaand aan de micro-injectie, zijn plasmide cDNAs verdund en gemengd om de gewenste uiteindelijke concentratie in TE-buffer of H 2 O. Typisch, 5-10 ng / ul van het reportergen is voldoende om geïnjecteerde cellen label, en de totale concentratie van cDNA te worden geïnjecteerd mag niet meer dan 200 ng / ul, omdat DNA is viskeus bij hoge concentraties en kunnen verstoppen injectie pipetten. Een klein volume van het cDNA voor injectie (5-10 pi) wordt bereid door het mengen van druppels van de oplossing op de schone oppervlak van een klein stukje van Parafilm (zijkant onder de papieren achterkant). Meng de druppels van de oplossing door pipetteren op en neer meerdere malen met een pipetor en voorkomen dat er luchtbellen tijdens het mixen. </li><li> Met behulp van een pipet microloader tip (Eppendorf, Brinkmann Instruments, Westbury, NY), overdracht van het cDNA oplossing voor een speciaal geprepareerde hematocriet buis (Fisher Scientific, Pittsburgh, PA). Zie materialen sectie voor instructies over het bereiden hematocriet buizen (Materialen tabel). Plaats de hematocriet buis met de cDNA injectie oplossing in een 1,5 ml microcentrifugebuis. </li><li> Centrifugeer de buis voor 15-30 minuten bij 10 000 g in een microcentrifuge is uitgerust met een vaste hoek of swingende emmer rotor (Eppendorf), bij kamertemperatuur (20-24 ° C) om sediment deeltjes in de cDNA oplossing die kan blokkeren de micro-injectie pipet. De cDNA-oplossing voor injectie kan worden bewaard bij kamertemperatuur tijdens de injectie sessie. </li></ol> B. Fabricatie van injectie pipetten <ol><li> Wegwerp glazen micro-injectie pipetten zijn commercieel verkrijgbaar (bijv. Femtotips, Eppendorf), die zijn handig, maar duur (10 dollar per micro-injectie pipet). Injectie pipetten kunnen worden vervaardigd in het laboratorium met behulp van een programmeerbare P-97 Flaming Brown pipet trekker (Sutter Instrument Company, Novato, CA) en filamented, dunwandige borosilicaatglas capillaire buisjes (World precisie-instrumenten, Sarasota, FL). Deze optie is meer kosteneffectief en zorgt voor de controle van micro-injectie pipet vorm en grootte. </li><li> Een twee-fase programma wordt gebruikt om smalle microinjectie pipetpunten trekken. Sinds de opening van de micro-injectie pipetten te smal is om te onderzoeken onder een lichtmicroscoop, de kwaliteit van de injectie pipetten moeten direct worden geëvalueerd door het injecteren van een paar cellen voor de programma-instellingen zijn afgerond. De volgende instellingen zijn bij benadering voor warmte, trek, snelheid en tijd instellingen: (pull 1) 600, 115, 15, 250, (pull 2) 640, 130, 65, 200. Deze instellingen variëren met verschillende batches van glas en door de toestand van de verwarming filament in de trekker, en dient te worden aangepast zoveel als nodig. Voor meer details zie 5. </li><li> Trek een aantal (2-5) injectie pipetten per schotel van neuronen te worden geïnjecteerd, in geval van schade of problemen tijdens de injectie sessie. Bewaar injectie pipetten in een afgedekte container om stof te voorkomen dat de micro-injectie pipet tip. </li></ol> II. Intranucleaire micro-injectie tent &quot;&gt; Dit hoofdstuk beschrijft het proces van het injecteren van cDNA in de kern van neuronen. Een eenvoudige micro-injectie set-up bestaat uit een omgekeerde fase-contrast microscoop (bijv. Nikon Diaphot TMD, Nikon, Melville, NY) om het proces te visualiseren, micromanipulator (bijv. Eppendorf 5171) om de beweging van de injectie pipet en een druk injector (bijv. Eppendorf FemtoJet Express) drukken om de cDNA-oplossing te verdrijven uit de pipet. aansluiten van de druk injector aan de micromanipulator zorgt voor de synchronisatie van de laatste twee processen tijdens injecties. Andere optioneel, maar wordt sterk aanbevolen, componenten zijn onder andere een gemonteerde video monitoring systeem (CCD-camera, Cohu Inc, San Diego, CA; zwart-wit video monitor, Sony Corporation, Tokio, Japan). Dit systeem is niet een absolute vereiste voor injecties; echter, de zwarte en witte monitor biedt een hoog contrast voor een betere visualisatie van de celkern en biedt een meer comfortabele kijkervaring tijdens lange injectie sessies. Daarnaast is een laptop computer met software om een ​​hand-held controller te bedienen kan worden gebruikt om semi- automatiseren van de injectie proces (zie Overleg voor details). Het ideale moment om SCG neuronen injecteren is 3-6 uur na de dissociatie. In dit stadium, de cellen zijn bolvormig, stevig bevestigd aan de bodem van de schaal, en de kern is duidelijk zichtbaar, onder een fase-contrast microscoop, als centrale ronde organel met een donkere membraan, met een enkele of meerdere nucleoli (Figuur 1A). <ol><li> Plaats een schotel van gedissocieerd neuronen in het midden van de microscoop podium. Stel het beeld scherp en het optimaliseren van de fase contrast optiek van de microscoop, zodat de kernen van neuronen zijn duidelijk zichtbaar. </li><li> Pipetteer 2 pi cDNA bereide oplossing in een micro-injectie pipet met behulp van een pipet microloader tip. Vermijden, up oplossing in de buurt van de bodem van de hematocriet buis, omdat dit kan opwekken deeltjes die gevestigd tijdens het centrifugeren. De gloeidraad in de micro-injectie pipetten moet de steun bij het opstellen oplossing voor de tip, maar als kleine luchtbelletjes blijven bestaan, tik zachtjes tegen de zijkant van het glas om ze te verjagen. </li><li> Steek de micro-injectie pipet in de capillaire houder van de druk injector en bevestig de houder aan de micromanipulator. De houder is vastgesteld op een hoek van 45 °. </li><li> Laat de micro-injectie pipet in de schaal. Omdat de pipet komt het kweekmedium, is een meniscus gevormd die van invloed op de breking van licht en verlaagt de beeldkwaliteit van de neuronen. Te verlichten dit probleem, kan de fase-ring-toren enigszins worden gecompenseerd tot de kernen van neuronen zijn duidelijk weer zichtbaar. </li><li> Enige druk injectie systemen hebben een &quot;schone&quot;-functie die maximale luchtdruk van de micro-injectie pipet tip voor een korte duur van toepassing. Gebruik deze functie om de pipet van puin te ruimen voor het begin en tijdens injecties als de tip verschijnt verstopt. Als verdreven vloeistof is niet zichtbaar op het scherm tijdens het gebruik van deze functie, te vervangen door een nieuwe injectie pipet. </li><li> Midden van de micro-injectie pipet in het weergavevenster monitor en lijn de tip naast een neuron en in hetzelfde focal plane als de nucleolus. Stel deze positie als de lagere z-as limiet op de micromanipulator. Deze positie is de diepte van de micro-injectie pipet zal om verder te gaan tijdens de injecties. Nu de positie van de tip ongeveer 30 micrometer boven dit punt, zodat de micro-injectie pipet wist de top van de neuronen. </li><li> Het &quot;injecteren&quot;-modus van een Eppendorf 5171 micromanipulator kan worden gedefinieerd met de volgende instellingen om intranucleaire injecties uit te voeren. Het injecteren functie is ingeschakeld, terwijl de spiesen functie is gebleven. Een diagonaal injectie pad (langs de x-en z-as) levert de minste hoeveelheid celbeschadiging, en dus ook de axiale modus moet worden gebruikt voor injecties. Een injectie snelheid van 300 um / s voldoende is, en synchroniseren drukopbouw als de micro-injectie pipet bereikt de set z-as te beperken. </li><li> De druk injector regelt de hoeveelheid cDNA-oplossing geïnjecteerd in de kern. In de &quot;automatische&quot; injectie-modus, de levering van DNA is de tijd-gestuurd en op initiatief van de aangesloten micromanipulator. De injectie druk (Pi) moet worden ingesteld tussen 100 tot 200 hectopascal (hPa; 1 hPa ~ 0.015 psi); hogere injectiedruk niet verbeteren slagingspercentages of kwaliteit van de injecties en kunnen andere problemen geven met de micro-injectie pipet tip grootte of de DNA zuiverheid . Een injectie duur (TI) van 0,3 s en een vergoeding druk (Pc) van 30 hPa, die een constante positieve druk om de toegang van de afsluiter deeltjes uit het kweekmedium in de pipet te voorkomen tip levert, worden gebruikt. </li><li> Plaats het neuron te worden geïnjecteerd onder het topje van de micro-injectie pipet met behulp van de microscoop van de xy-as stadium controle. Lijn het puntje van de pipet boven het midden van de kern door te focussen heen en weer tussen tHij tip en de nucleoli. </li><li> Injecteer de kern door te drukken op de knop injecteren (op de micromanipulator). Voor de injectie stap worden de beweging van de micro-injectie pipet en de vrijlating van cDNA-oplossing gecontroleerd door de micromanipulator. Het is moeilijk om een ​​succesvolle intranucleaire injecties te bevestigen door het oog, maar de injectie van de relatief lage viscositeit cDNA-oplossing (in vergelijking met de viskeuze nucleaire milieu), vaak verschijnt als een witte pluim onder fase-contrast optica en kan gebruikt worden als een indicator van de injectie in de kern. Soms is de micro-injectie pipet niet doordringen in de kernmembraan en gewoon duwt de kern. Een tweede injectie poging op dezelfde positie kan leiden tot een succesvolle injectie van DNA in de kern. Zwelling van de cel is meestal een indicatie van onbedoelde cytoplasmatische injectie. Ook is het belangrijk nucleaire zwelling niet goed verdragen door de neuronen en meestal resulteert in celdood kort daarna, dus de inspuitdruk en de duur mag niet meer dan de aanbevolen waarden. </li><li> Ga verder injecteren van neuronen door de herpositionering van de microscoop etappe naar de volgende neuron af te stemmen onder de micro-injectie pipet. Systematisch navigeren door de schotel op ongeveer 50 tot 100 kernen injecteren alvorens terug te keren de schotel van neuronen naar de incubator voor overnachting incubatie. Met succes geïnjecteerd neuronen kan worden geïdentificeerd van de volgende dag door expressie van het reportergen. </li></ol> III. Representatieve resultaten <img src="/files/ftp_upload/1614/1614fig1.jpg" alt="Figuur 1" /> Figuur 1: Superior cervicale ganglion (SCG) neuronen. Fase contrast beeld van SCG neuronen 3 uur post-dissociatie (A). In dit stadium, de kern is duidelijk zichtbaar wat helpt uitlijning van de micro-injectie pipet tip. De kern verschijnt in het midden van de neuronen met een enkele (links) of meerdere (rechts) dark nucleoli. SCG neuronen 16 uur na de injectie van EGFP cDNA in de kern (B). Links, SCG neuronen bekeken onder fase-contrast verlichting. Rechts, epifluorescerende beeld van dezelfde neuronen met succesvolle injectie en de daaruit voortvloeiende EGFP expressie in een neuron. Witte schaal bar is 20 micrometer. <img src="/files/ftp_upload/1614/1614figure2tmb.jpg" alt="Figuur 2" border="0" /> Figuur 2: whole-cell opnames van stromen door middel van heteroloog tot expressie G-eiwit gekoppelde innerlijk herstellen van K + (GIRK) kanalen van SCG neuronen. GIRK stromen (I GIRK) werden opgeroepen door een 200 ms spanning helling -140 tot 40 mV van een bedrijf potentieel van -60 mV (inzet van A) na activatie van endogene α 2-receptoren door norepinefrine (NE, 10 uM) . Gesuperponeerd sporen zijn opnames van dezelfde neuron en vermeld voor (zwart) en na toepassing van een van beide NE alleen (blauw) of NE plus 10 mM Ba 2 + (rood). Onderbroken lijnen geven het huidige niveau nul. Voor het opnemen ik GIRK, het ingeperkte externe oplossing (in mm) 130 NaCl, KCl 5,4, 10 HEPES, 10 CaCl2, 0,8 MgCl 2, 15 glucose, sucrose 15 en 0,0003 TTX, op pH 7,4 met NaOH. De interne opname oplossing bevatte (in mm) 135 KCl, 11 EGTA, een CaCl 2, 2 MgCl 2, 10 HEPES, 4 MgATP, en 0,3 Na 2 GTP, op pH 7,2 met KOH. Het gebrek aan stroom opgewekt door de spanning ramp in de aanwezigheid van NE in uninjected SCG neuronen (A) toont aan dat SCG neuronen niet drukken endogene GIRK kanalen. Succesvolle injectie van plasmide cDNA dat codeert voor een functioneel GIRK kanaal 11 geeft aanleiding tot grote stromen tijdens het voltage oprit bij blootstelling aan NE (B, links). Stromingen hebben de typische kenmerken van de stromen via GIRK kanalen: activering door een G-eiwit gekoppelde receptor agonist (NE), actieve rectificatie, en blokkeren van de stromen door de vermeende GIRK-blokker, Ba 2 + (B, rechts rood spoor). Open en gevulde cirkels vertegenwoordigen ik GIRK op het bedrijf en de piekstroom respectievelijk. Gelieve <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/1614/1614figure2.jpg">Klik hier</a> voor een grotere versie van figuur 2 te zien.

<ol>
	<li>Eccles, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+action+potential+of+the+superior+cervical+ganglion.">The action potential of the superior cervical ganglion.</a> J Physiol. 85, 179-206 (1935).</li><li>Ikeda, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Voltage-dependent+modulation+of+N-type+calcium+channels+by+G-protein+&#x03B2;&#x03B3;+subunits.">Voltage-dependent modulation of N-type calcium channels by G-protein &#x03B2;&#x03B3; subunits.</a> Nature. 380, 255-258 (1996).</li><li>Schofield, G. G., Ikeda, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Potassium+currents+of+acutely+isolated+adult+rat+superior+cervical+ganglion+neurons.">Potassium currents of acutely isolated adult rat superior cervical ganglion neurons.</a> Brain Res. 485, 205-214 (1989).</li><li>Schofield, G. G., Ikeda, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sodium+and+calcium+currents+of+acutely+isolated+adult+rat+superior+cervical+ganglion+neurons.">Sodium and calcium currents of acutely isolated adult rat superior cervical ganglion neurons.</a> Pflugers Arch. 411, 481-490 (1988).</li><li>Dean, D. A., Goldman, R. D., Spector, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chapter+4.">Chapter 4.</a> Live Cell Imaging: a Laboratory Manual. 1, 51-66 (2005).</li><li>Ikeda, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heterologous+expression+of+receptors+and+signaling+proteins+in+adult+mammalian+sympathetic+neurons+by+microinjection.">Heterologous expression of receptors and signaling proteins in adult mammalian sympathetic neurons by microinjection.</a> Methods Mol Biol. 83, 191-202 (1997).</li><li>Ikeda, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+G-protein+signaling+components+in+adult+mammalian+neurons+by+microinjection.">Expression of G-protein signaling components in adult mammalian neurons by microinjection.</a> Methods Mol Biol. 259, 167-181 (2004).</li><li>Ikeda, S. R., Jeong, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+RGS-insensitive+G&#x03B1;+subunits+to+study+endogenous+RGS+protein+action+on+G-protein+modulation+of+N-type+calcium+channels+in+sympathetic+neurons..">Use of RGS-insensitive G&#x03B1; subunits to study endogenous RGS protein action on G-protein modulation of N-type calcium channels in sympathetic neurons..</a> Methods Enzymol. 389, 170-189 (2004).</li><li>Washbourne, P., McAllister, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Techniques+for+gene+transfer+into+neurons.">Techniques for gene transfer into neurons.</a> Curr Opin Neurobiol. 12, 566-573 (2002).</li><li>Zhang, Y., Yu, L. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+microinjection+technology+in+cell+biology.">Single-cell microinjection technology in cell biology.</a> Bioessays. 30, 606-610 (2008).</li><li>Vivaudou, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Probing+the+G-protein+regulation+of+GIRK1+and+GIRK4,+the+two+subunits+of+the+KACh+channel,+using+functional+homomeric+mutants.">Probing the G-protein regulation of GIRK1 and GIRK4, the two subunits of the KACh channel, using functional homomeric mutants.</a> J Biol Chem. 272, 31553-31560 (1997).</li></ol>

Voorkomende problemen en suggesties: Zoals eerder vermeld, een succesvolle nucleaire injecties zijn afhankelijk van die cellen aanhanger van weefselkweek platen. Het uitstellen van de start van de injecties een paar uur na de cel dissociatie procedure laat neuronen te houden aan de onderkant van gerechten. Daarnaast, coating gerechten met 0,1 mg / ml met een hoog molecuulgewicht poly-L-lysine (Sigma, St. Louis, MO) helpt de hechting van neuronen aan de onderkant van de gerechten. Blokkering van micro-injectie pipetten, vooral als een poging om een ​​hoge concentratie van DNA injecteren, kan een veel voorkomend probleem te zijn. Met behulp van hoge kwaliteit scheiding kolommen te isoleren en te zuiveren plasmide DNA, en het uitvoeren van de bijkomende zuiveringsstappen vermeld (spin filters, spinning in hematocriet buizen) kan helpen om deeltjes te verwijderen voorafgaand aan de injectie. Tijdens de injecties, kan de &quot;schone&quot; functie van de druk injector worden gebruikt (bij 0,2 s is voldoende), maar als dat het probleem niet oplost, een nieuwe injectie pipet moet worden gebruikt. Als de meerderheid van micro-injectie pipetten verstopt raken tijdens een injectie sessie, overweeg dan het veranderen van de instellingen van de glazen pipet trekker naar micro-injectie pipetpunten te produceren met een grotere opening. Een ander probleem dat zich voordoet tijdens de nucleaire injecties is de oneffenheden van de onderkant van weefselkweek gerechten. Deze variabiliteit rechtstreeks van invloed op de doelgerichtheid nauwkeurigheid van de injectie pipet tips om de kern, omdat de diepte van de pipet doorkruist tijdens de injecties is opgelost. Daarom moet dit z-as grens worden aangepast in de loop van injecties in hetzelfde gerecht. Het zal duidelijk zijn wanneer een aanpassing nodig is: er zal geen aanwijzing van nucleaire injectie (geen witte pluim in de kern of de cel is volledig gemist), of de injectie pipet tip komt dicht bij de bodem van de schaal (het comprimeren van de cel of zelfs crashen van de pipet tip in de bodem van de schaal). Glas-klonen cilinders (. OD 10 mm, Cat No 2.090 tot 01.010, Bellco Glas, Vineland, New Jersey), kan worden gebruikt tijdens de beplating van de neuronen om hen te beperken in een kleinere, meer beperkt gebied, dus het minimaliseren van de afstand die nodig is om te bewegen de injectie pipet tussen de injecties. Deze klonen cilinders zijn verwijderd voor het uitvoeren van micro-injecties. Nadelen van de techniek: Intranucleaire micro-injecties zijn technisch veeleisend, die vereisen geduld en een hoge mate van handvaardigheid door de operator. Vaardigheid met deze techniek, net als bij elke andere vaardigheid, komt met de praktijk. Het is dus aangeraden om alleen de praktijk nucleaire injecties van het reporter-gen voordat de werkelijke experimenten. Ter verdere ondersteuning van de injectie proces, kan het mogelijk zijn om de stappen van de micromanipulator en druk injector in een computerprogramma te consolideren. Programma&#39;s zoals Igor Pro (WaveMetrics, Lake Oswego, OR) kan worden gebruikt om micro-injectie instellingen op te slaan en te multifunctionele regelaars (ShuttlePRO, Contour Design, Windham, NH) programma om semi-automatiseren van de injectie proces (zie 6,7,8 voor details). Een ander nadeel van de intranucleaire micro-injectie techniek is het lage slagingspercentage. Ongeveer 10-20% van poging tot kernenergie injecties leiden tot eiwitexpressie. Terwijl dit rendement kan voldoende zijn voor toepassingen die niet nodig een groot aantal uit te drukken cellen, elektrofysiologie bijvoorbeeld voor verschillende biochemische assays kan dit niet voldoende zijn. Toepassingen van techniek: Ondanks de nadelen, intranucleaire micro-injectie van DNA is een zeer nuttige techniek voor het heteroloog tot expressie eiwitten in neuronen. Hoge niveaus van eiwitexpressie worden bereikt met nucleaire micro-injecties vanwege het grote aantal plasmiden vrij in de kern tijdens de injecties, een zeer actieve CMV promoter reguleren van gentranscriptie, en een lange stabiliteit van plasmiden in de kern. Eiwit over-expressie is vooral nuttig in de dominant-negatieve experimenten waarbij een hoog niveau van heterologe eiwitten zijn nodig om de endogene eiwit overweldigen. Een ander voordeel van intranucleaire injecties is de mogelijkheid om een ​​consistent deel van de cDNA constructen te leveren aan de kern wanneer er meerdere constructen geïnjecteerd. Met andere transfectie methoden, is het moeilijk om reproduceerbaar te introduceren hetzelfde aandeel van elke DNA in verschillende cellen te bouwen binnen hetzelfde gerecht en tussen transfecties. Directe injectie van cDNA-oplossing in de kern elimineert deze bron van variabiliteit en laat de verhouding van tot expressie gebrachte eiwitten effectief worden getitreerd. Traditionele transfectie methoden hebben een beperkt effect in de post-mitotische cellen vanwege de lage opname van DNA in de kern 9 en chemische toxiciteit geassocieerd met transfectie Reagouders 10. Nucleaire micro-injecties overwinnen van deze problemen door de invoering van genetisch materiaal mechanisch in de kern. Hoewel deze techniek is meer betrokken, de mogelijkheid om het effect van een eiwit in een biologisch systeem functioneel onderzoek, compleet met endogene signaalwegen, meer dan compenseert voor de moeizame karakter van deze techniek. Alle experimentele procedures op dieren werden uitgevoerd in overeenstemming met de National Institutes of Health Guidelines for Animal Care en gebruik.

<!DOCTYPE html PUBLIC "-//W3C//DTD XHTML 1.0 Transitional//EN" "http://www.w3.org/TR/xhtml1/DTD/xhtml1-transitional.dtd">
<html xmlns="http://www.w3.org/1999/xhtml" xml:lang="en" lang="en">	
		
		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>Ultrafree-MC Filter Unit</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Millipore</td>
<td>UFC30VV00</td>
<td>Durapore PVDF filter; 0.1 &mu;m pore-size</td>
</tr>
<tr>
<td>TE buffer</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Quality Biological, Inc</td>
<td>351-010-131</td>
<td>10 mM Tris, 1 mM EDTA, pH 8.0</td>
</tr>
<tr>
<td>Micro-hematocrit capillary tubes</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fisher Scientific</td>
<td>22-362-574</td>
<td>Unheparinized Preparation: 
Soak in 100% ethanol overnight. Wash thoroughly with deionized water three times and dry bake glass in an oven (95&deg;C). Cut the cleaned hematocrit tubes into 3-4 cm length pieces using a diamond-tipped scriber, and seal one end closed with a flame and forceps to hold the glass. Store in a clean glass beaker and cover to prevent dust build-up. </td>
</tr>
<tr>
<td>Microcentrifuge</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Eppendorf</td>
<td>5417 R</td>
<td>With a fixed angle or swinging-bucket rotor</td>
</tr>
<tr>
<td>Microloader 20 &mu;l pipet tips</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Eppendorf</td>
<td>5242 956.003</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Microinjection capillary glass</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>World Precision Instruments</td>
<td>TW120F-4</td>
<td>Thin-walled with filament, 1.2 mm outer-diameter, 0.9 mm inner-diameter, 100 mm length</td>
</tr>
<tr>
<td>Flaming/Brown Micropipette Puller</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sutter Instrument Co.</td>
<td>P-97</td>
<td>With platinum-iridium box filament (part # FB330B)</td>
</tr>
<tr>
<td>Nikon Diaphot TMD Inverted Microscope</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Nikon</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>20x and 40x phase-contrast objective lenses, mounted on a vibration isolation table</td>
</tr>
<tr>
<td>Charge-coupled device (CCD) camera </td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Cohu Inc.</td>
<td>6410</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Video monitor</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sony Corporation</td>
<td>PVM-122</td>
<td>Black and White, 9&#x201D; screen </td>
</tr>
<tr>
<td>Micromanipulator system</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Eppendorf</td>
<td>5171</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Microinjection Unit</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Eppendorf</td>
<td>FemtoJet Express</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Microinjection controller</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Contour Design</td>
<td>S-PROV2</td>
<td>Programmable multimedia controller</td>
</tr>
<tr>
<td>Igor Pro</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>WaveMetrics</td>
<td>Version 4.05A</td>
<td>Command program to control the microinjection controller written by S. Ikeda</td>
</tr>		</tbody>
		</table>
		</div>

intranuclear microinjection of dna into dissociated adult mammalian neurons

Primaire neuronale celkweken zijn waardevolle instrumenten om de functies van eiwitten bestuderen, omdat zij vertegenwoordigen een meer biologisch relevante systeem in vergelijking met onsterfelijk cellijnen. Echter, de post-mitotische aard van de primaire neuronen voorkomt effectief heterologe eiwitexpressie het gebruik van gemeenschappelijke procedures zoals elektroporatie of chemisch-gemedieerde transfectie. Dus, moeten andere technieken worden gebruikt om doeltreffend te kunnen eiwitten uit te drukken in deze niet-delende cellen. In dit artikel beschrijven we de stappen die nodig zijn om intranucleaire injecties van cDNA constructen te doen naar gedissocieerd volwassen sympathische neuronen. Deze techniek, die is toegepast op verschillende soorten neuronen, met succes kan veroorzaken heterologe eiwit expressie. De apparatuur van essentieel belang voor de micro-injectie procedure omvat een omgekeerde microscoop naar de cellen, een glas injectie pipet gevuld met cDNA-oplossing die is verbonden met een N 2 (g) druk aflevering systeem, en een micromanipulator visualiseren. De micromanipulator coördineert de injectie beweging van micro-injectie pipet met een korte puls van druk N 2 tot en met cDNA-oplossing uit te werpen uit de pipet tip. Deze techniek heeft niet de toxiciteit in verband met vele andere transfectie methoden en kunnen meerdere DNA-constructen worden uitgedrukt in een consistente verhouding. Het lage aantal geïnjecteerde cellen maakt de micro-injectie procedure zeer geschikt voor single cell studies zoals elektrofysiologische opnamen en optische beeldvorming, maar is wellicht niet ideaal voor biochemische assays dat een groter aantal cellen en de hogere transfectie efficiëntie vereisen. Hoewel intranucleaire micro-injecties een investering van apparatuur en de tijd, de mogelijkheid om hoge niveaus van heterologe eiwit expressie te bereiken in een fysiologisch relevante omgeving maakt deze techniek een zeer nuttig instrument om eiwit functie te onderzoeken.

Watch this Scientific Journal Video about Intranuclear Microinjection of DNA into Dissociated Adult Mammalian Neurons at JoVE.com

Intranuclear Microinjection of DNA into Dissociated Adult Mammalian Neurons

Directe intranucleaire injectie van cDNA is een effectieve techniek voor transfectie post-mitotische cellen. Deze methode biedt een hoge mate van heterologe eiwitexpressie van een of meerdere cDNA constructen en maakt het mogelijk eiwit functie die moet worden bestudeerd in een fysiologisch relevante omgeving met een verscheidenheid van enkele cel assays.

Intranucleaire micro-injectie van DNA in gedissocieerde Adult zoogdieren Neuronen

Primary neuronal cell cultures are valuable tools to study protein function since they represent a more biologically relevant system compared to ...

Research

JoVE Journal

Biology

Preparation of Dissociated Mouse Cortical Neuron Cultures

De voorbereiding van gescheiden Mouse Cortical Neuron culturen

This video will guide you through the process for generating cortical neuronal cultures from late embryo and early postnatal mouse brain. These cultures ...

DNA Transfection of Mammalian Skeletal Muscles using In Vivo Electroporation

DNA Transfection of Mammalian Skeletal Muscles using In Vivo Electroporation

DNA Transfectie van zoogdieren skeletspieren met behulp van In Vivo Elektroporatie

 A growing interest in cell biology is to express transgenically modified forms of essential proteins (e.g. fluorescently tagged constructs and/or mutant ...

Analysis of DNA Double-strand Break (DSB) Repair in Mammalian Cells

Analysis of DNA Double-strand Break DSB Repair in Mammalian Cells

Analyse van DNA dubbelstrengs breuken (DSB) Reparatie in zoogdiercellen

DNA double-strand breaks are the most dangerous DNA lesions that may lead to massive loss of genetic information and cell death.  Cells repair DSBs using ...

Intraperitoneal Injection into Adult Zebrafish

Intraperitoneale injectie in de Adult zebravis

A convenient method for chemically treating zebrafish is to introduce the reagent into the tank water, where it will be taken up by the fish. However, ...

Analysis of mRNA Nuclear Export Kinetics in Mammalian Cells by Microinjection

Analyse van de mRNA Nuclear Export Kinetics in zoogdiercellen door micro-injectie

In eukaryotes, messenger RNA (mRNA) is transcribed in the nucleus and must be exported into the cytoplasm to access the translation machinery. Although ...

Analyzing the Function of Small GTPases by Microinjection of Plasmids into Polarized Epithelial Cells

Het analyseren van de functie van kleine GTPases door micro-injectie van Plasmids in de gepolariseerde epitheelcellen

Epithelial cells polarize their plasma membrane into biochemically and functionally distinct apical and basolateral domains where the apical domain faces ...

Transplantation of Cells Directly into the Kidney of Adult Zebrafish

Transplantatie van cellen direct in de nieren van Volwassen zebravis

Regenerative medicine based on the transplantation of stem or progenitor cells into damaged tissues has the potential to treat a wide range of chronic ...

In vivo Electroporation of Morpholinos into the Adult Zebrafish Retina

In vivo Electroporation of Morpholinos into the Adult Zebrafish Retina

In vivo Elektroporatie van Morpholinos in de Adult zebravis Retina

Many devastating inherited eye diseases result in progressive and irreversible blindness because humans cannot regenerate dying or diseased retinal ...

In vivo Electroporation of Morpholinos into the Regenerating Adult Zebrafish Tail Fin

In vivo Electroporation of Morpholinos into the Regenerating Adult Zebrafish Tail Fin

In vivo Elektroporatie van Morpholinos in het regenereren van Adult Zebravissen Tail Fin

Certain species of urodeles and teleost fish can regenerate their tissues. Zebrafish have become a widely used model to study the spontaneous regeneration ...

Efficient Differentiation of Mouse Embryonic Stem Cells into Motor Neurons

Efficiënte Differentiatie van muis embryonale stamcellen in de motorische neuronen

Direct differentiation of embryonic stem (ES) cells into functional  motor neurons represents a promising resource to study disease mechanisms, to  screen ...