Name: intranuclear microinjection of dna into dissociated adult mammalian neurons
Uploaded: 2009-12-10T17:10:00
Duration: 13 min 39 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Intranuclear Microinjection of DNA into Dissociated Adult Mammalian Neurons at JoVE.com

Наши лабораторные исследования при поддержке Внутренние программы исследований NIH, Национальный институт по злоупотреблению алкоголем и алкоголизму.

<ol>
	<li>Eccles, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+action+potential+of+the+superior+cervical+ganglion.">The action potential of the superior cervical ganglion.</a> J Physiol. 85, 179-206 (1935).</li><li>Ikeda, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Voltage-dependent+modulation+of+N-type+calcium+channels+by+G-protein+&#x03B2;&#x03B3;+subunits.">Voltage-dependent modulation of N-type calcium channels by G-protein &#x03B2;&#x03B3; subunits.</a> Nature. 380, 255-258 (1996).</li><li>Schofield, G. G., Ikeda, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Potassium+currents+of+acutely+isolated+adult+rat+superior+cervical+ganglion+neurons.">Potassium currents of acutely isolated adult rat superior cervical ganglion neurons.</a> Brain Res. 485, 205-214 (1989).</li><li>Schofield, G. G., Ikeda, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sodium+and+calcium+currents+of+acutely+isolated+adult+rat+superior+cervical+ganglion+neurons.">Sodium and calcium currents of acutely isolated adult rat superior cervical ganglion neurons.</a> Pflugers Arch. 411, 481-490 (1988).</li><li>Dean, D. A., Goldman, R. D., Spector, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chapter+4.">Chapter 4.</a> Live Cell Imaging: a Laboratory Manual. 1, 51-66 (2005).</li><li>Ikeda, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heterologous+expression+of+receptors+and+signaling+proteins+in+adult+mammalian+sympathetic+neurons+by+microinjection.">Heterologous expression of receptors and signaling proteins in adult mammalian sympathetic neurons by microinjection.</a> Methods Mol Biol. 83, 191-202 (1997).</li><li>Ikeda, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+G-protein+signaling+components+in+adult+mammalian+neurons+by+microinjection.">Expression of G-protein signaling components in adult mammalian neurons by microinjection.</a> Methods Mol Biol. 259, 167-181 (2004).</li><li>Ikeda, S. R., Jeong, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+RGS-insensitive+G&#x03B1;+subunits+to+study+endogenous+RGS+protein+action+on+G-protein+modulation+of+N-type+calcium+channels+in+sympathetic+neurons..">Use of RGS-insensitive G&#x03B1; subunits to study endogenous RGS protein action on G-protein modulation of N-type calcium channels in sympathetic neurons..</a> Methods Enzymol. 389, 170-189 (2004).</li><li>Washbourne, P., McAllister, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Techniques+for+gene+transfer+into+neurons.">Techniques for gene transfer into neurons.</a> Curr Opin Neurobiol. 12, 566-573 (2002).</li><li>Zhang, Y., Yu, L. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+microinjection+technology+in+cell+biology.">Single-cell microinjection technology in cell biology.</a> Bioessays. 30, 606-610 (2008).</li><li>Vivaudou, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Probing+the+G-protein+regulation+of+GIRK1+and+GIRK4,+the+two+subunits+of+the+KACh+channel,+using+functional+homomeric+mutants.">Probing the G-protein regulation of GIRK1 and GIRK4, the two subunits of the KACh channel, using functional homomeric mutants.</a> J Biol Chem. 272, 31553-31560 (1997).</li></ol>

Общие проблемы и предложения: Как уже упоминалось ранее, успешное ядерное инъекции зависят от наличия клетки приверженцем пластины тканевой культуры. Отсрочка начала инъекции несколько часов после процедуры клеточной диссоциации позволяет нейронам придерживаться нижней части блюда. Кроме того, покрытие блюда с 0,1 мг / мл с высокой молекулярной массой поли-L-лизин (Sigma, Сент-Луис, Миссури) помогает адгезии нейронов к нижней поверхности посуды. Закупорка микроинъекции пипец, особенно при попытке придать высокую концентрацию ДНК, могут быть частые проблемы. Использование высоких разделительных колоннах качества, чтобы изолировать и очищать плазмидной ДНК, а также выполнение дополнительных стадий очистки упоминается (спиновые фильтры, вращающиеся в трубах гематокрита) может помочь, чтобы удалить частицы до инъекций. Во время инъекции, &quot;чистых&quot; от давления инжектор может быть использован (по 0,2 с достаточно), но если это не помогает решить проблему, новый пипетки инъекции должна быть использована. Если большинство микроинъекции пипец засоряются во время инъекции сессии рассмотрит, изменяя настройки съемник пипетки стеклянные для получения советов микроинъекции пипетки с большим открытием. Еще один вопрос, который возникает при ядерных инъекций неровности нижней поверхности блюда тканевой культуры. Эта изменчивость непосредственно влияет на точность целеуказания советов инъекции пипетки в ядро ​​с глубины пипетка проходит во время инъекций не будет устранена. Таким образом, этот оси предел должен быть скорректированы в ходе инъекций в течение одной посуды. Это будет очевидно, когда корректировка необходима: не будет никаких признаков ядерной инъекций (не белый шлейф в ядре или ячейка пропустил полностью), или кончиком пипетки инъекции приближается к нижней части блюда (сжатие ячейки или даже сбой пипетки наконечник в нижней части блюда). Стекло-клонирование цилиндров (. OD 10 мм, № по 2090-01010, Bellco Стекло, Вайнленд, Нью-Джерси) может быть использована во время покрытия нейронов ограничить их в меньшие, более ограниченном пространстве, поэтому сведение к минимуму расстояние, необходимое для перемещения инъекции пипетки между инъекциями. Эти клонирования цилиндров удаляются до выполнения микроинъекций. Недостатки метода: Внутриядерных микроинъекции являются технически сложных, требующих терпения и высокой степенью ловкости рук оператора. Знание с этой техникой, как и любой другой навык, приходит с практикой. Таким образом, рекомендуется практиковать ядерное инъекции гена-репортера только перед тем, реальных экспериментах. Для оказания дальнейшей помощи инъекции процесса, это может быть возможным, чтобы консолидировать шаги микроманипулятора и давление инжектора в компьютерной программе. Такие программы, как Игорь Pro (WaveMetrics, Lake Oswego, OR) могут быть использованы для хранения микроинъекции настройки и программировать многофункциональные контроллеры (ShuttlePro, Contour Design, Windham, NH), чтобы полу-автоматизировать процесс инжекции (см. 6,7,8 для подробности). Еще одним недостатком внутриядерных техника микроинъекции увенчивается успехом. Примерно 10-20% попыток ядерной инъекции приводят к экспрессии белка. В то время эта эффективность может быть достаточно для приложений, которые не требуют большого количества клеток, экспрессирующих, электрофизиологии, например, для различных биохимических анализов это не может быть достаточным. Применение методики: Несмотря на все недостатки, внутриядерных микроинъекции ДНК является чрезвычайно полезным методом для выражения heterologously белков в нейронах. Высокий уровень экспрессии белка достигается с ядерными микроинъекции из-за большого количества плазмид выпущен в ядро ​​во время инъекции, высокой активностью ЦМВ промоутер регулирующих транскрипцию генов, и долго стабильность плазмид в ядре. Белки чрезмерное выражение особенно полезно в доминантно-негативного эксперименты, в которых высокий уровень гетерологичных белков требуется подавить эндогенного белка. Еще одно преимущество внутриядерных инъекций способность обеспечить последовательное доля кДНК конструкции для ядра, когда несколько конструкций вводятся. С другими методами трансфекции, трудно воспроизводимо ввести такой же пропорции каждого ДНК-конструкции в различные клетки в то же блюдо, а также между трансфекции. Прямой впрыск кДНК решение в ядро ​​устраняет этот источник изменчивости и позволяет отношение выразили белки быть оттитрованы эффективно. Традиционные методы трансфекции имеют ограниченную эффективность в пост-делящихся клеток из-за низкой включение ДНК в ядре 9 и химическая токсичность, связанная с трансфекции КГНродителей 10. Ядерная микроинъекций преодолеть эти проблемы путем введения генетического материала механически в ядре. Хотя этот метод является более сложным, возможность изучения влияния белка в функциональной биологической системы, в комплекте с эндогенными сигнальных путей, более чем компенсирует трудоемкость этого метода. Все экспериментальные процедуры на животных были проведены в соответствии с Национальными институтами здравоохранения Руководство по уходу и использованию животных.

<!DOCTYPE html PUBLIC "-//W3C//DTD XHTML 1.0 Transitional//EN" "http://www.w3.org/TR/xhtml1/DTD/xhtml1-transitional.dtd">
<html xmlns="http://www.w3.org/1999/xhtml" xml:lang="en" lang="en">	
		
		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>Ultrafree-MC Filter Unit</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Millipore</td>
<td>UFC30VV00</td>
<td>Durapore PVDF filter; 0.1 &mu;m pore-size</td>
</tr>
<tr>
<td>TE buffer</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Quality Biological, Inc</td>
<td>351-010-131</td>
<td>10 mM Tris, 1 mM EDTA, pH 8.0</td>
</tr>
<tr>
<td>Micro-hematocrit capillary tubes</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fisher Scientific</td>
<td>22-362-574</td>
<td>Unheparinized Preparation: 
Soak in 100% ethanol overnight. Wash thoroughly with deionized water three times and dry bake glass in an oven (95&deg;C). Cut the cleaned hematocrit tubes into 3-4 cm length pieces using a diamond-tipped scriber, and seal one end closed with a flame and forceps to hold the glass. Store in a clean glass beaker and cover to prevent dust build-up. </td>
</tr>
<tr>
<td>Microcentrifuge</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Eppendorf</td>
<td>5417 R</td>
<td>With a fixed angle or swinging-bucket rotor</td>
</tr>
<tr>
<td>Microloader 20 &mu;l pipet tips</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Eppendorf</td>
<td>5242 956.003</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Microinjection capillary glass</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>World Precision Instruments</td>
<td>TW120F-4</td>
<td>Thin-walled with filament, 1.2 mm outer-diameter, 0.9 mm inner-diameter, 100 mm length</td>
</tr>
<tr>
<td>Flaming/Brown Micropipette Puller</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sutter Instrument Co.</td>
<td>P-97</td>
<td>With platinum-iridium box filament (part # FB330B)</td>
</tr>
<tr>
<td>Nikon Diaphot TMD Inverted Microscope</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Nikon</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>20x and 40x phase-contrast objective lenses, mounted on a vibration isolation table</td>
</tr>
<tr>
<td>Charge-coupled device (CCD) camera </td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Cohu Inc.</td>
<td>6410</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Video monitor</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sony Corporation</td>
<td>PVM-122</td>
<td>Black and White, 9&#x201D; screen </td>
</tr>
<tr>
<td>Micromanipulator system</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Eppendorf</td>
<td>5171</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Microinjection Unit</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Eppendorf</td>
<td>FemtoJet Express</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Microinjection controller</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Contour Design</td>
<td>S-PROV2</td>
<td>Programmable multimedia controller</td>
</tr>
<tr>
<td>Igor Pro</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>WaveMetrics</td>
<td>Version 4.05A</td>
<td>Command program to control the microinjection controller written by S. Ikeda</td>
</tr>		</tbody>
		</table>
		</div>

intranuclear microinjection of dna into dissociated adult mammalian neurons

Первичная нейронных клеточных культур являются ценным инструментом для изучения функции белка, так как они представляют собой более биологически соответствующие системы по сравнению с увековечены клеточных линий. Тем не менее, пост-митотического природа первичных нейронов, препятствует эффективному гетерологичной экспрессии белка с помощью обычных процедур, таких как электропорации или химически-опосредованной трансфекции. Таким образом, другие методы должны быть использованы для того, чтобы эффективно выражать белков в этих не делящихся клеток. В этой статье мы опишем шаги, необходимые для выполнения внутриядерных инъекции кДНК конструкции в диссоциированных взрослых симпатических нейронов. Эта техника, которая была применена для различных типов нейронов, может успешно вызвать гетерологичной экспрессии белка. Оборудования, необходимого для микроинъекции процедура включает в себя инвертированный микроскоп для визуализации клеток, пипетки стеклянные инъекции заполнены кДНК решение, которое связано с N 2 (г) системы доставки давления и микроманипулятора. Микроманипулятора координаты инъекции движения микроинъекции пипетки с краткого импульса под давлением N 2, чтобы извлечь кДНК раствор из пипетки чаевые. Эта техника не имеет токсичность, связанная со многими другими методами трансфекции и позволяет нескольким конструкции ДНК, которые будут высказаны на последовательное отношение. Низкое число вводили клетки делает микроинъекции процедура хорошо подходит для одного исследования клеток, таких как электрофизиологических записей и оптических изображений, но не может быть идеальным для биохимических анализов, которые требуют большего количества клеток и более высокую эффективность трансфекции. Хотя внутриядерных микроинъекций потребует инвестиций в оборудование и время, способность достичь высокого уровня экспрессии гетерологичных белка в физиологически соответствующих среды делает этот метод очень полезным инструментом для исследования функции белка.

Watch this Scientific Journal Video about Intranuclear Microinjection of DNA into Dissociated Adult Mammalian Neurons at JoVE.com

Intranuclear Microinjection of DNA into Dissociated Adult Mammalian Neurons

Прямой впрыск внутриядерных кДНК является эффективным методом трансфекции для пост-митозе. Этот метод обеспечивает высокий уровень экспрессии гетерологичных белка из одного или нескольких кДНК конструкций и позволяет функции белка, чтобы быть изучены в соответствующих физиологически среде с различными одного анализов клеток.

Внутриядерных микроинъекции ДНК в диссоциированных взрослых млекопитающих Нейроны

Primary neuronal cell cultures are valuable tools to study protein function since they represent a more biologically relevant system compared to ...

Research

JoVE Journal

Biology

Preparation of Dissociated Mouse Cortical Neuron Cultures

Подготовка диссоциированных Мышь корковых культур Нейрон

This video will guide you through the process for generating cortical neuronal cultures from late embryo and early postnatal mouse brain. These cultures ...

DNA Transfection of Mammalian Skeletal Muscles using In Vivo Electroporation

DNA Transfection of Mammalian Skeletal Muscles using In Vivo Electroporation

Трансфекция ДНК млекопитающих скелетных мышц использованием В Vivo Электропорация

 A growing interest in cell biology is to express transgenically modified forms of essential proteins (e.g. fluorescently tagged constructs and/or mutant ...

Analysis of DNA Double-strand Break (DSB) Repair in Mammalian Cells

Analysis of DNA Double-strand Break DSB Repair in Mammalian Cells

Анализ ДНК двухцепочечной Break (DSB) Ремонт в клетках млекопитающих

DNA double-strand breaks are the most dangerous DNA lesions that may lead to massive loss of genetic information and cell death.  Cells repair DSBs using ...

Intraperitoneal Injection into Adult Zebrafish

Внутрибрюшинного введения в взрослых данио рерио

A convenient method for chemically treating zebrafish is to introduce the reagent into the tank water, where it will be taken up by the fish. However, ...

Analysis of mRNA Nuclear Export Kinetics in Mammalian Cells by Microinjection

Анализ мРНК ядерного Кинетика Экспорт в клетках млекопитающих по Микроинъекция

In eukaryotes, messenger RNA (mRNA) is transcribed in the nucleus and must be exported into the cytoplasm to access the translation machinery. Although ...

Analyzing the Function of Small GTPases by Microinjection of Plasmids into Polarized Epithelial Cells

Анализ функций малого ГТФаз по микроинъекции Плазмиды в поляризованных эпителиальных клеток

Epithelial cells polarize their plasma membrane into biochemically and functionally distinct apical and basolateral domains where the apical domain faces ...

Transplantation of Cells Directly into the Kidney of Adult Zebrafish

Трансплантация клеток непосредственно в почках взрослых данио рерио

Regenerative medicine based on the transplantation of stem or progenitor cells into damaged tissues has the potential to treat a wide range of chronic ...

In vivo Electroporation of Morpholinos into the Adult Zebrafish Retina

In vivo Electroporation of Morpholinos into the Adult Zebrafish Retina

В естественных условиях электропорации Morpholinos в Retina взрослых данио рерио

Many devastating inherited eye diseases result in progressive and irreversible blindness because humans cannot regenerate dying or diseased retinal ...

In vivo Electroporation of Morpholinos into the Regenerating Adult Zebrafish Tail Fin

In vivo Electroporation of Morpholinos into the Regenerating Adult Zebrafish Tail Fin

В естественных условиях электропорации Morpholinos в Восстанавливающий взрослых данио рерио хвостового плавника

Certain species of urodeles and teleost fish can regenerate their tissues. Zebrafish have become a widely used model to study the spontaneous regeneration ...

Efficient Differentiation of Mouse Embryonic Stem Cells into Motor Neurons

Эффективное Дифференциация эмбриональных стволовых клеток мыши в моторные нейроны

Direct differentiation of embryonic stem (ES) cells into functional  motor neurons represents a promising resource to study disease mechanisms, to  screen ...