Name: engineering cell-permeable protein
Uploaded: 2009-12-28T15:00:00
Duration: 21 min 8 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Engineering Cell-permeable Protein at JoVE.com

Мы благодарим Оливера Brüstle и всех членов инженерно стволовых клеток группы, Боннский университет, за поддержку и ценные обсуждения. Мы благодарим Сабина Шенк для подготовки SDS-PAGE и прочной поддержкой на протяжении всего проекта. Николь Руси и Анна Magerhans при условии, отличную техническую поддержку. Кроме того, мы хотели бы поблагодарить Андреаса и Шейла Бэр Мертенса для производства фильма. Эта работа была поддержана грантами фонда Фольксваген (Az I/77864) и германского министерства образования и научных исследований (BMBF, 01 GN 0813).

Строительство вектор экспрессии и выражения: PSESAME-Cre вектор экспрессии была построена вставка Cre-кодирования фрагмента в pSESAME через AvrII и NheI сайты рестрикции с использованием стандартных методов клонирования. pSESAME кодирует белок слияния, состоящий из гистидина-теги, ТАТ-область, NLS последовательности и Cre, сокращенно HTNCre. Для выражения HTNCre pSESAME-Cre было преобразовано в TUNER (DE3) pLacI и используется для подготовки глицерина акций. <ol><li> В течение ночи культуру засевают использованием пипетки наконечник покрытием с преобразованным бактерий из глицерина акций. В течение ночи культуры состояла из LB среде с 0,5% глюкозы [об. /] и карбенициллин в конечной концентрации 50 мкг / мл и было позволено расти при температуре 37 ° С в течение 16 часов. </li><li> На следующий день густо выросли на ночь культуры используют для инокуляции выражение культуры в соотношении 1 к 40 и был помещен в инкубатор при 37 ° C. Выражение культуры состояла из ТБ среде с 0,5% глюкозы [об. /] и ампициллин в конечной концентрации 100 мкг / мл. </li><li> В OD 595 из 1,5 выражение культуры вызывали с 0,5 мМ IPTG в течение 1 ч. </li><li> Впоследствии бактерий были собраны путем центрифугирования при 5000 оборотах в минуту в течение 10 минут в SLA3000 ротора. </li><li> Бактерии гранулы хранились при температуре минус 20 ° С до очистки. </li></ol> Очистка ячейки проницаемой белка: <ol><li> Замороженные гранулы бактерии ресуспендировали в 10 мл лизирующего буфера на литр культуры колбу в течение 15 минут при комнатной температуре. </li><li> Затем суспензию инкубировали с 1 мг / мл лизоцима еще на 15 минут при перемешивании при комнатной температуре. </li><li> 25 Ед / мл benzonase был добавлен позже и инкубировали при перемешивании в течение 15 минут при комнатной температуре. </li><li> После озвучивания на льду в течение 1,5 мин с 0,5 импульсов с при 45% мощности, 1 мл холодного буфера соль винной (БСЭ) в мл суспензии осторожно добавляют при перемешивании и выдерживают в течение 5 мин на льду. SDS-PAGE образец лизат фракции (L) принято не было. </li><li> Очищенные лизат получали центрифугированием при 4 ° С в течение 30 мин при 30000 g. SDS-PAGE образцов растворимого (S) и нерастворимых фракций (I) были приняты. </li><li> Супернатант переносили в 50 мл свежего труб сокола и был затем осторожно перемешивают в течение 1 ч при 4 ° С с 2 мл 50% Ni-NTA шлама на литр первичной культуры выражения. </li><li> Суспензию упакованы в самотеком EconoPac колонке (SDS-PAGE образец проточного фракции (FT) была сделана) и дважды промывают 5 постельное объемов моющий буфер. SDS-PAGE образцах как мытье фракций (W1 и W2) были собраны. </li><li> HTNCre-содержащие фракции элюировали 3 постельное объемами буфера элюирования и образца элюата фракции (Е) для SDS-PAGE анализа был взят. </li><li> Имидазола удаляли диализа элюирования фракция против высоких буфера соли в два раза. </li><li> Раствора белка еще более концентрируется диализа против буфера глицерина в два раза. Во всех диализных шаги отношение буфер для образца, по крайней мере 50. Эта процедура привела к решению глицерина семенного материала, HTNCre в обычной концентрации от 200 до 450 мкм, то есть 1 литр выражение культуры приведет к ~ 12 мг белка. Пример глицерина акций (GS) для SDS-PAGE анализа была собрана. HTNCre маточный раствор можно хранить при температуре минус 20 ° С. </li></ol><img border="0" src="/files/ftp_upload/1627/1627fig1tmb.jpg" alt="Рисунок 1" /> Рисунок 1: SDS-PAGE анализа проб, взятых при очистке Cre рекомбиназы. Индукция выражение Cre указывается доминирующей группой в лизат фракции. Хотя часть белка нерастворимые белки Cre может быть обогащен как видно из элюата и фракции глицерина акций. L: лизат, я: Не растворяется, S: Супернатант, FT: проточные, Вт: стиральная, E: элюата, Г. С.: Gylcerol бирже. Пожалуйста, <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/1627/1627fig1.jpg">нажмите здесь</a> , чтобы видеть большую версию рисунке 1. Белки трансдукции в мышиных эмбриональных стволовых (ЭС) клеток: <ol><li> ES клеток, несущих условной β-галактозидазы репортер 5 построить высевают как отдельные клетки, используя TrypLE ™ Express для диссоциации прилипшие клетки. После 4-х до 6 часов клетки было повторное подключение и среду удаляли. </li><li> Впоследствии ЭС клетки инкубировали с HTNCre среде, содержащей в течение 16 часов. <ul><li> Соответствующее количество белка HTNCre (соответствует 10 мкМ) из глицерина акции разбавляли в среду ES, а затем стерильной фильтрации (0,22 мкм). </li></ul></li><li> После среду белков трансдукции был изменен обратно в нормальный средний рост. </li><li> После двух дней клетки промывали PBS и фиксировали 4% Параформальдегид (PFA) в течение 10 минут. </li><li> Два дополнительныхных этапов промывки с PBS были казнены до X-Gal окрашивание проводилось. </li><li> Фиксированные клетки были покрыты слоем X-Gal красящим раствором 6 и инкубировали в течение ночи при температуре 37 ° C. </li></ol> Представитель Результаты: На следующий день X-Gal окрашивание раствора стремилась и клетки были покрыты слоем PBS для микроскопии анализа. От 80 до 100% от рекомбинированное клетки можно было наблюдать в мышиных клетках ES судить по β-галактозидазы.

<ol>
	<li>Gump, J. M., Dowdy, S. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TAT+transduction:+the+molecular+mechanism+and+therapeutic+prospects.">TAT transduction: the molecular mechanism and therapeutic prospects.</a> Trends Mol Med. 13 (10), 443-448 (2007).</li><li>Edenhofer, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+transduction+revisited:+novel+insights+into+the+mechanism+underlying+intracellular+delivery+of+proteins.">Protein transduction revisited: novel insights into the mechanism underlying intracellular delivery of proteins.</a> Curr Pharm Des. 14 (34), 3628-3636 (2008).</li><li>Branda, C. S., Dymecki, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Talking+about+a+revolution:+The+impact+of+site-specific+recombinases+on+genetic+analyses+in+mice.">Talking about a revolution: The impact of site-specific recombinases on genetic analyses in mice.</a> Dev Cell. 6 (1), 7-28 (2004).</li><li>Nolden, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Site-specific+recombination+in+human+embryonic+stem+cells+induced+by+cell-permeant+Cre+recombinase.">Site-specific recombination in human embryonic stem cells induced by cell-permeant Cre recombinase.</a> Nat Methods. 3 (6), 461-467 (2006).</li><li>Zhang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inducible+site-directed+recombination+in+mouse+embryonic+stem+cells.">Inducible site-directed recombination in mouse embryonic stem cells.</a> Nucleic Acids Res. 24 (4), 543-548 (1996).</li><li>Peitz, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhanced+purification+of+cell-permeant+Cre+and+germline+transmission+after+transduction+into+mouse+embryonic+stem+cells.">Enhanced purification of cell-permeant Cre and germline transmission after transduction into mouse embryonic stem cells.</a> Genesis. 45 (8), 508-517 (2007).</li><li>Bosnali, M., Edenhofer, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+transducible+versions+of+transcription+factors+Oct4+and+Sox2.">Generation of transducible versions of transcription factors Oct4 and Sox2.</a> Biol Chem. 389 (7), 851-861 (2008).</li><li>Landry, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Runx+genes+are+direct+targets+of+Scl/Tal1+in+the+yolk+sac+and+fetal+liver.">Runx genes are direct targets of Scl/Tal1 in the yolk sac and fetal liver.</a> Blood. 111 (6), 3005-3014 (2008).</li></ol>

Во время процесса очистки слитый белок Cre важно не пропустить добавлением льда буфера холодной TBS перед центрифугированием. В противном случае Cre рекомбиназы имеет тенденцию осаждаться внутри глицерина буфера. Если элюата фракция появляется, чтобы стать мутной из-за высокой концентрации гибридный белок дополнительного буфера элюирования следует добавить, пока раствор не прояснилось снова. Применение 10 мкмоль белка слияния Cre обычно приводит к рекомбинации эффективность от 80 до 100%. Эмбриональной телячьей сыворотки (FCS) является одной из основных компонент среднего ячейки ES сильно подавляет белок трансдукции. Поэтому высокая концентрация Cre рекомбиназы должны были быть использованы. При работе в бессывороточной условиях меньше белка (0,5 - 2 мкм) может быть использован для достижения аналогичных эффективность рекомбинации. С системой pSESAME вектор в стороны, можно применить технику белков трансдукции к другим белкам, включая транскрипционные факторы, такие как Oct4 и Sox2 7 и Scl/Tal1 8.

<!DOCTYPE html PUBLIC "-//W3C//DTD XHTML 1.0 Transitional//EN" "http://www.w3.org/TR/xhtml1/DTD/xhtml1-transitional.dtd">
<html xmlns="http://www.w3.org/1999/xhtml" xml:lang="en" lang="en">	
		
		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>TUNER (DE3) pLacI</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Novagen</td>
<td>70625</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Glycerol</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Carl Roth</td>
<td>3783.2</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Na2HPO4</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Roth</td>
<td>T876.1</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Trizma Base</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma-Aldrich</td>
<td>T1503</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>HCl</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Roth</td>
<td>4625.1</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Imidazol</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Roth</td>
<td>X998.4</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>NaCl</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Roth</td>
<td>9265.2</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Yeast Extract</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Roth</td>
<td>2363.4</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Trypton/Pepton</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Roth</td>
<td>8952.4</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>K2HPO4 </td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Roth</td>
<td>P749.2</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>KH2PO4</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Roth</td>
<td>3904.1</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Ampicillin</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>A9518</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Carbenicillin</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>6344.2</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>HEPES</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>H3375</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Lysozyme</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>62971</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Benzonase</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Novagen</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>L-Tartaric acid, disodium salt </td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>50% Ni-NTA slurry</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>R901-15</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>EconoPac columns</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Biorad</td>
<td>732-1010</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Sterile filter 0,22&mu;m</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Whatman</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Paraformaldehyde (PFA)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>LB medium</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Yeast extract, Trypton/Pepton, NaCl</td>
</tr>
<tr>
<td>TB medium</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Yeast extract, Trypton/Pepton, Glycerol, K2HPO4, KH2PO4</td>
</tr>
<tr>
<td>Lysis Buffer</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>50 mM Na2HPO4, 5 mM Tris, pH 7.8</td>
</tr>
<tr>
<td>Tartaric Salt Buffer (TSB)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>PTB containing 2 M L-Tartaric acid, disodium salt, and 20 mM Imidazol</td>
</tr>
<tr>
<td>Washing Buffer</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>PTB, 500 mM NaCl, 15 mM Imidazol</td>
</tr>
<tr>
<td>Elution Buffer</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>PTB, 500 mM NaCl, 250 mM Imidazol</td>
</tr>
<tr>
<td>High Salt Buffer</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>600 mM NaCl, 20 mM HEPES, pH 7.4</td>
</tr>
<tr>
<td>Gylcerol Buffer</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>50% glycerol, 500 mM NaCl, 20 mM HEPES, pH 7.4</td>
</tr>
<tr>
<td>TrypLE&trade; Express</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>ESGRO (LIF)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Millipore</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>NEAA</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Gibco</td>
<td>11140035</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>L-Glutamin</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Gibco</td>
<td>25030024</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>&beta;-Mercaptoethanol</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Gibco</td>
<td>31350010</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>DMEM</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Gibco</td>
<td>11960044</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>PBS</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Gibco</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Fetal Calf Serum (FCS)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>PAA</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>X-Gal staining solution:</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>4 mM K3(FeIII(CN)6), 4 mM K4(FeII(CN)6), 2mM MgCl2 0.4 mg/mL X-Gal solved in PBS</td>
</tr>
<tr>
<td>K3(FeIII(CN)6)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>P-3367</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>K4 (FeII(CN)6)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>P-9387</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>MgCl2</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>M8266</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>X-Gal</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>B4252</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

engineering cell-permeable protein

Техника белков трансдукции позволяет прямой доставки биологически активных веществ в клетках млекопитающих [см. обзор 1,2]. Для этого можно использовать translocating способность так называемого ячейки проникающих пептидов (ППС), также обозначается как белка трансдукции доменов (PTDs). TAT-CPP происходит от иммунодефицита человека вирусом типа 1 (ВИЧ-1) Tat (транс-активатор транскрипции) белок широко используется. Положительно заряженные ТАТ способствует клеточной проницаемости тем самым преодолевая барьеры клеточной мембраны путем эндоцитоза и / или прямое проникновение мембраны 2. В сочетании с сигнал ядерной локализации (NLS) слитые белки способны проникать ядра выставке функциональность. Наши видео-презентацию демонстрирует, как иллюстрация для инженерных клеточных белков проницаемой, строительства, производства и применения клеточных проницаемой версию ДНК-модифицирующие фермент Cre. Cre является конкретным участкам рекомбиназы, который может распознавать и рекомбинировать 34 база сайтов пара loxP в клетках млекопитающих в пробирке и в естественных условиях. Поэтому Cre / loxP система широко используется для условного вызывать мутации в геноме живых клеток 3,4. Доставки активных Cre рекомбиназы к клеткам, однако, представляет собой ограничение. Мы описываем системы pSESAME вектор, который позволяет прямое включение гена интересов, и предоставляет платформу для быстрого клона разных доменах и тегов, используемых в вектор в удобной и стандартизованным образом. Реорганизация различных тегов, как было показано изменение биохимических свойств белков слияния предоставление возможности для достижения более высокой урожайности и лучшей растворимости. Мы демонстрируем, как можно выразить и очистить рекомбинантных клеточных белков в проникающий и от кишечной палочки. Функциональность рекомбинантный белок Cre, наконец, утверждены в культуре клеток, оценивая его внутриклеточной активности рекомбиназы.

Watch this Scientific Journal Video about Engineering Cell-permeable Protein at JoVE.com

Engineering Cell-permeable Protein

Белки трансдукции позволяет прямой доставки биологически активных белков в клетки. В отличие от традиционных методов, таких как трансфекции ДНК или вирусной трансдукции этой неинвазивной парадигма позволяет высокоэффективных сотовых манипуляции в титруемой образом в обход сотового токсичность и риск онкогенных преобразование постоянного генетической модификации.

Инженерно Cell-проницаемой белка

The protein transduction technique enables the direct delivery of biologically active material into mammalian cells [for review see 1,2]. For this one can ...

Research

JoVE Journal

Biology

Experimental Approaches to Tissue Engineering

Экспериментальные подходы к тканевой инженерии

Micro-scale Engineering for Cell Biology

Микро-масштаба Техника для клеточной биологии

Staining of Proteins in Gels with Coomassie G-250 without Organic Solvent and Acetic Acid

Окрашивание белков в гелях Кумасси G-250 без органических растворителей и уксусной кислоты

In classical protein staining protocols using Coomassie Brilliant Blue (CBB), solutions with high contents of toxic and flammable organic solvents ...

Electrospinning Fibrous Polymer Scaffolds for Tissue Engineering and Cell Culture

Электропрядения Волокнистые Строительные леса Полимер для тканевой инженерии и клеточной культуры

As the field of tissue engineering evolves, there is a tremendous demand to produce more suitable materials and processing techniques in order to address ...

Cellular Encapsulation in 3D Hydrogels for Tissue Engineering 

Сотовая Инкапсуляция в 3D гидрогелей для тканевой инженерии

The 3D encapsulation of cells within hydrogels represents an increasingly important and popular technique for culturing cells and towards the development ...

Using the GELFREE 8100 Fractionation System for Molecular Weight-Based Fractionation with Liquid Phase Recovery

Использование GELFREE 8100 Фракционирование Система Молекулярный вес основе фракционирования с жидким этапе восстановления

The GELFREE 8100 Fractionation System is a novel protein fractionation system designed to maximize protein recovery during molecular weight based ...

Imaging Protein-protein Interactions in vivo

Imaging Protein-protein Interactions in vivo

Изображениями белок-белковых взаимодействий В естественных условиях</em

Protein-protein interactions are a hallmark of all essential cellular processes. However, many of these interactions are transient, or energetically weak, ...

Automated Hydrophobic Interaction Chromatography Column Selection for Use in Protein Purification

Автоматизированная гидрофобные взаимодействия хроматографии на колонке выбора для использования в очистки белков

In contrast to other chromatographic methods for purifying proteins (e.g. gel filtration, affinity, and ion exchange), hydrophobic interaction ...

Protein WISDOM: A Workbench for In silico De novo Design of BioMolecules

Protein WISDOM: A Workbench for In silico De novo Design of BioMolecules

Белки МУДРОСТЬ Workbench для<em&gt; В кремнии</em&gt;<em&gt; De Novo</em&gt; Дизайн биомолекул

The aim of de novo protein design is to find the amino acid sequences that will fold into a desired 3-dimensional structure with improvements in specific ...

Mouse Genome Engineering Using Designer Nucleases

Мышь Геном Инжиниринг Использование конструктора нуклеаз

Transgenic mice carrying site-specific genome modifications (knockout, knock-in) are of vital importance for dissecting complex biological systems as well ...