Name: preparation of embryos for electron microscopy of the drosophila embryonic heart tube
Uploaded: 2009-12-21T10:00:00
Duration: 9 min 23 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Preparation of embryos for Electron Microscopy of the Drosophila embryonic heart tube at JoVE.com

העבודה שלנו על היווצרות צינור לב נתמך על ידי קרן המדע הלאומית גרנט (ID פרס 0744165) כדי SGK

<ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> טרי להכין 2ml של פתרון מקבע המכיל Glutaraldehyde 12.5% ​​במאגר Cacodylate 50mm (pH7.4) בתוך צנצנת זכוכית 20 מ&quot;ל הנצנץ. הוסף 8ml של n-heptane ומנערים במרץ. אפשר להפריד בין שני שלבים. הסר השלב העליון המכיל n-heptane רווי glutaraldehyde, מקום לתוך בקבוקון scintillation נקי ומניחים בצד. זה יהיה הפתרון מקבע. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> איסוף עוברים שעה 0-20 באמצעות אוסף העובר קאמרית, שהוא סל קטן עם להוסיף רשת נשלפים. הסר את הקרום החיצוני סיסית על ידי השריית עוברים בפתרון אקונומיקה 50% במשך 2-3 דקות, או עד עוברי לצוף אל פני השטח של אקונומיקה. לשטוף ביסודיות עם עוברי ddH20 ואת כתם על מגבת נייר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעזרת מלקחיים, להרים להכניס רשת אשר מכוסה עוברים dechorionated ומקום לתוך הפתרון מקבע, המאפשר עוברים ליפול מן הרשת. אפשר לתקן את עוברי עבור 1.5 שעות ב 4 ° C תוך כדי ערבוב על Nutator. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכינו צלחת פטרי מצופה קלטת דו צדדית. הסר עוברים מן מקבע באמצעות pipet פסטר ומניחים אותם על גבי משטח מודבק של פטרי dish.Transfer העוברים בסכום מינימלי של פתרון מקבע למנוע heptane ב מקבע מ המסת הדבק של הקלטת. נער את צלחת פטרי כדי ליצור שכבה יחידה של העוברים. מניחים צלחת פטרי במנדף עד מתאדה heptane. הוסף מספיק Tween20 PBS + 0.1% כדי לכסות את העוברים. יד devitellinize בסוף שלב 16 עוברים תחת מיקרוסקופ לנתח עם מחט טונגסטן בוטה. שחזור עוברים עם pipet פסטר לתוך צינור מ&quot;ל 1.5 microfuge. צעדים 5-7 מתבצעים בתוך צינור זה microfuge. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף עוברים 0.1M Cacodylate חיץ, pH 7.4 ואז שלאחר לתקן בתמיסה המכילה tetroxide אוסמיום 1% ב 0.1M Cacodylate חוצץ, pH 7.4 שעה 1 בטמפרטורת החדר. שטפו עוברי עם 0.1M Cacodylate חיץ, pH 7.4. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מייבשים עוברים בסדרה מדורגת של אתנול, אצטון. מייבשים עוברים עם אתנול 50% למשך 10 דקות, ואחריו אתנול 70% למשך 10 דקות. ואז מייבשים אצטון ב 90% במשך 10 דקות, ושני אצטון 100% מדרגות 10 דקות כל אחד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר אצטון ואז להתחיל את תהליך חדירת ידי הוספת שרף-EPON Spurr 01:01: תערובת אצטון על עוברים. מיקרוגל במשך שלוש דקות באמצעות מיקרוגל Biowave Pelco Pro תוך שמירה על מדגם בלחץ ואקום. החל הלחץ ואקום המדגם עבור חמש דקות נוספות לאחר מיקרוגל הסתיים. הבורסה שרף 01:01, תערובת אצטון עם שרף-EPON Spurr 100% מיקרוגל שוב תחת לחץ ואקום. 100% Exchange-EPON Spurr שרף בפעם האחרונה, ו מיקרוגל בלחץ ואקום. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שימוש pipet פסטר, העוברים מועברים מהצינור microfuge לעצב הטבעה סיליקון. יישר עוברים בשורה כזאת, כי בסופו האחורי של העובר מתיישר עם הקצה החד של עובש. אופים בתנור 70 ° C במשך הלילה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר מדגם ולהתכונן חתך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בגין קיצוץ בסעיפים 1μm באמצעות סכין יהלום histo ריקרט Ultracut E Microtome. שימו לב, כאשר סעיף העובר הראשון הוא הגיע. מנקודה זו, לחתוך 100μm לתוך המדגם. הסר קטע באמצעות לולאה, ואת המקום לשקופית זכוכית. בקצרה החום סעיף על פלטה חשמלית. הכתם בסעיף באמצעות ירידה של מתילן בלו. תחת מיקרוסקופ אור לזהות את לומן לב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חותכים סעיפים 90 ננומטר באמצעות Ultra יהלום 45 ° סכין ריקרט Ultracut E Microtome. תרימי מספר מקטעים על רשת הנחושת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> רשתות מגואלות אצטט uranyl 3% רווי באתנול 50% למשך עשר דקות ולאחר מכן לשטוף שלוש פעמים במים מזוקקים כפול. ואז, רשתות הם מוכתמים להוביל ציטרט (0.04gms מומס במים מזוקקים 10 מ&quot;ל כפול NaOH 10M 100 מ&quot;ל) עבור 2.5 דקות בתא המכיל כדורי NaOH ליצור CO 2 ללא הסביבה. רשתות הן שטפה שלוש פעמים במים מזוקקים כפול. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מדורים נבחנים עם מיקרוסקופ אלקטרונים JEOL 1200EX ב 80Kv, וצילם עם מצלמה דיגיטלית AMT. </li></ol>

<ol>
	<li>Tepass, U., Hartenstein, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Development+of+Cellular+Junctions+in+the+Drosophila+embryo.">The Development of Cellular Junctions in the Drosophila embryo.</a> Dev. Biol. 161, 563-596 (1994).</li><li>Sullivan, W., Ashburner, M., Hawley, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Drosophila Protocols. , (2000).</li><li>Santiago-Martinez, E., Soplop, N. H., Patel, R., Kramer, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Repulsion+by+Slit+and+Roundabout+prevents+Shotgun/E-cadherin-mediated+cell+adhesion+during+Drosophila+heart+tube+lumen+formation.">Repulsion by Slit and Roundabout prevents Shotgun/E-cadherin-mediated cell adhesion during Drosophila heart tube lumen formation.</a> J. Cell Biol. 182, 241-248 (2008).</li></ol>

המורפוגנזה של הצינור לב תסיסנית עובריים התפתחה כמערכת מודל חשוב ללימוד הידבקות התא שינויים בצורת התא במהלך ההתפתחות העוברית. אחד האתגרים העומדים בפני בלימוד מבנה זה הוא כי לומן של הצינור לב קשה לחזות בעוברים הר שלם. הטכניקה הפגינו וידאו זה, אשר הותאמה מהנהלים שתואר לעיל 1-2, הוכיח להצליח יעיל ומהימן ניתוח מספר לא מבוטל של גנוטיפים עבור צינור לב היווצרות לומן 3.

preparation of embryos for electron microscopy of the drosophila embryonic heart tube

המורפוגנזה של<em&gt; תסיסנית</em&gt; צינור הלב העוברי התפתחה כמערכת מודל יקר ערך לחקר נדידת תאים, תאים תאים הידבקות שינויים בצורת התא במהלך ההתפתחות העוברית. אחד האתגרים העומדים בפני בלימוד מבנה זה הוא כי לומן של הצינור לב, כמו גם את תכונות הממברנה כי הם קריטיים ליצירת צינור לב, קשה לחזות בעוברים הר שלמה, בשל גודלו הקטן של הצינור לב ו התוך lumenal יחסית העובר בחלל. השימוש במיקרוסקופ אלקטרונים השידור מאפשר הגדלה גבוהה יותר של מבנים אלה ונותן את היתרון של בדיקת העוברים חתך, אשר בקלות מגלה את גודלו וצורתו של לומן. בסרטון הזה, אנו בפירוט את תהליך קיבוע אמין, הטבעה, ואת חתך של שלב מאוחר<em&gt; תסיסנית</em&gt; עוברים כדי להמחיש את הצינור לב לומן, כמו גם מבנים תאיים חשובים, כולל תאים תאים צמתים הממברנה במרתף.

Watch this Scientific Journal Video about Preparation of embryos for Electron Microscopy of the Drosophila embryonic heart tube at JoVE.com

Preparation of embryos for Electron Microscopy of the Drosophila embryonic heart tube

אנו מתארים תהליך להטבעת קיבעון, חתך, הדמיה של שלב מאוחר<em&gt; תסיסנית</em&gt; עוברים מיקרוסקופית אלקטרונים Trasmission של הצינור לב עוברי. טכניקה זו מאפשרת הדמיה של לומן צינור לב, כמו גם את קרום במרתף, שבו הקווים לומן של הלב.

הכנת עוברים אלקטרונים מיקרוסקופית של תסיסנית לב עוברי צינור

The morphogenesis of the Drosophila  embryonic heart tube has emerged as a valuable model system for studying cell migration, cell-cell adhesion and cell ...

Research

JoVE Journal

Biology

Preparation of embryos for Electron Microscopy of the Drosophila embryonic heart tube

Preparation of Neuronal Cultures from Midgastrula Stage Drosophila Embryos

הכנת תרבויות העצבית מ Midgastrula עוברים שלב תסיסנית

This video illustrates the procedure for making primary neuronal cultures from midgastrula stage Drosophila embryos. The methods for collecting embryos ...

The Preparation of Drosophila Embryos for Live-Imaging Using the Hanging Drop Protocol

The Preparation of Drosophila Embryos for Live-Imaging Using the Hanging Drop Protocol

הכנת תסיסנית עוברים Live-הדמיה באמצעות פרוטוקול Drop Hanging

Green fluorescent protein (GFP)-based timelapse live-imaging is a powerful technique for studying the genetic regulation of dynamic processes such as ...

Fluorescent Labeling of Drosophila Heart Structures

Fluorescent Labeling of Drosophila Heart Structures

תיוג של פלורסנט תסיסנית לב מבנים

The Drosophila melanogaster dorsal vessel, or heart, is a tubular structure comprised of a single layer of contractile cardiomyocytes, pericardial cells ...

Visualizing the Beating Heart in Drosophila

Visualizing the Beating Heart in Drosophila

לדמיין את הלב הפועם תסיסנית</em

The Drosophila heart has recently emerged as a good model system for examining the genetic, cellular, and molecular mechanisms underlying function in ...

Preparation of Drosophila S2 cells for Light Microscopy

Preparation of Drosophila S2 cells for Light Microscopy

הכנת תסיסנית תאים S2 עבור במיקרוסקופ אור

The ideal experimental system would be cheap and easy to maintain, amenable to a variety of techniques, and would be supported by an extensive literature ...

A Novel Ex vivo Culture Method for the Embryonic Mouse Heart

A Novel Ex vivo Culture Method for the Embryonic Mouse Heart

רומן<em&gt; Ex vivo</em&gt; שיטת תרבות ללב העכבר העוברית

Developmental studies in the mouse are hampered  by the inaccessibility of the embryo during gestation. Thus, protocols to  isolate and culture individual ...

Drosophila Preparation and Longitudinal Imaging of Heart Function In Vivo Using Optical Coherence Microscopy (OCM)

Drosophila Preparation and Longitudinal Imaging of Heart Function In Vivo Using Optical Coherence Microscopy OCM

הכנת תסיסנית והדמיה אורכית תפקוד הלב in vivo באמצעות מיקרוסקופית קוהרנטיות אופטית (OCM)

Longitudinal study of the heartbeat in small animals contributes to understanding structural and functional changes during heart development. Optical ...

Sample Preparation and Imaging of Exosomes by Transmission Electron Microscopy

הכנת הדוגמא והדימות של Exosomes על ידי במיקרוסקופ אלקטרונים הילוכים

Exosomes are nano-sized extracellular vesicles secreted by body fluids and are known to represent the characteristics of cells that secrete them. The ...

Miniaturized Sample Preparation for Transmission Electron Microscopy

הכנת הדוגמא ולמחקר במיקרוסקופ אלקטרונים הילוכים

Due to recent technological progress, cryo-electron microscopy (cryo-EM) is rapidly becoming a standard method for the structural analysis of protein ...

Biological Sample Preparation by High-pressure Freezing, Microwave-assisted Contrast Enhancement, and Minimal Resin Embedding for Volume Imaging

הכנת הדוגמא ביולוגית על ידי הקפאת בלחץ גבוה, שיפור ניגודיות בסיוע מיקרוגל, ושרף מינימלי הטמעה של אמצעי הדמיה

The described sample preparation technique is designed to combine the best quality of ultrastructural preservation with the most suitable contrast for the ...