Name: in vivo-like organotypic murine retinal wholemount culture
Uploaded: 2010-01-11T17:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about In vivo-like Organotypic Murine Retinal Wholemount Culture at JoVE.com

Les auteurs tiennent à remercier E. de la Rosa et AI Valenciano de l&#39;aide initiale avec la mise en place des cultures organotypiques et U. Laub et U. Gerster d&#39;assistance technique.

Tout le matériel et les réactifs doivent être achetés stérile ou doit être la chaleur ou stérilisé à la vapeur ou stérilisé avec de l&#39;EtOH 70%. Les auteurs indiquent que les expériences sur les animaux ont été effectuées en conformité avec les Communautés européennes la directive du Conseil (86/609/CEE), suivant les directives du NIH concernant les soins et l&#39;utilisation d&#39;animaux pour des procédures expérimentales et les règlements énoncés par le comité i...

<ol>
	<li>Rieke, M., Gottwald, E., Weibezahn, K. -. F., Layer, P. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+reconstruction+in+3D-spheroids+from+rodent+retina+in+a+motion-free,+bioreactor-based+microstructure.">Tissue reconstruction in 3D-spheroids from rodent retina in a motion-free, bioreactor-based microstructure.</a> Lab. Chip. 8, 2006-2213 (2008).</li><li>Donovan, S. L., Dyer, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+and+square+wave+electroporation+of+retinal+explant+cultures.">Preparation and square wave electroporation of retinal explant cultures.</a> Nature Protocols. 1, 2710-2718 (2006).</li><li>Duenker, N., Valenciano, A. I., Franke, A., Hernandez-Sanchez, C., Dressel, R., Behrendt, M., de Pablo, F., Krieglstein, K., de la Rosa, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Balance+of+pro-apoptotic+transforming+growth+factor-beta+and+anti-apoptotic+insulin+effects+in+the+control+of+cell+death+in+the+postnatal+mouse+retina.">Balance of pro-apoptotic transforming growth factor-beta and anti-apoptotic insulin effects in the control of cell death in the postnatal mouse retina.</a> Eur. J. Neurosci. 22, 28-38 (2005).</li><li>Franke, A. G., Gubbe, C., Beier, M., Duenker, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transforming+growth+factors+beta+and+Bone+morphogenetic+proteins:+Cooperative+players+in+chick+and+murine+programmed+retinal+cell+death.">Transforming growth factors beta and Bone morphogenetic proteins: Cooperative players in chick and murine programmed retinal cell death.</a> J. Comp. Neurol. 495, 263-278 (2005).</li><li>de la Rosa, E. J., D&#237;az, B., De Pablo, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organoculture+of+the+chick+embryonic+neuroretina.">Organoculture of the chick embryonic neuroretina.</a> Curr. Top. Dev. Biol. 36, 133-144 (1998).</li><li>Dohle, D. S., Pasa, S. D., Gustmann, S., Laub, M., Wissler, J. H., Jennissen, H. P., Duenker, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chick+ex+ovo+culture+and+ex+ovo+CAM+assay:+How+it+really+works.">Chick ex ovo culture and ex ovo CAM assay: How it really works.</a> J Vis Exp. 32, (2009).</li></ol>

L&#39;avantage de 2-5 murin organotypiques rétine cultures wholemount plus de dissociation, monocouche, retinospheroid ou ré-agrégées 3D cultures sphéroïde 1 réside dans la préservation des interactions neuronales et de connexions, imitant la situation in vivo. En comparaison avec les anciens rapports 2, notre article vidéo fournit une démonstration détaillée des particularités de l&#39;énucléation des yeux murin et la dissection des rétines de différen...

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		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>Mice</td>
<td>Animal</td>
<td>Charles Rivers Laboratories</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Dissection microscope</td>
<td>Tool</td>
<td>ZEISS</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>PBS</td>
<td>Reagent</td>
<td>Sigma</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>PBS should be cold (&gt; 4&deg;C) and sterile</td>
</tr>
<tr>
<td>Dulbecco`s modified eagle`s medium / nutrient mixture F-12 Ham</td>
<td>Reagent</td>
<td>Sigma</td>
<td>D 8900</td>
<td>DMEM / F-12</td>
</tr>
<tr>
<td>Apo-transferin</td>
<td>Reagent</td>
<td>Sigma</td>
<td>T 1147</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Putrescin</td>
<td>Reagent</td>
<td>Sigma</td>
<td>P 5780</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Sodium selenite</td>
<td>Reagent</td>
<td>Sigma</td>
<td>S 9133</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Progesterone</td>
<td>Reagent</td>
<td>Sigma</td>
<td>P 6149</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Gentamicine</td>
<td>Reagent</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>L-Glutamine</td>
<td>Reagent</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>25030-024</td>
<td>200 mM (100X), liquid</td>
</tr>
<tr>
<td>Bovine serum albumine (BSA)</td>
<td>Reagent</td>
<td>Roth</td>
<td>8076.3</td>
<td>30 mg/ml</td>
</tr>
<tr>
<td>Collagenase</td>
<td>Reagent</td>
<td>Sigma</td>
<td>C 0773</td>
<td>200 U/ml</td>
</tr>
<tr>
<td>Trypsin</td>
<td>Reagent</td>
<td>Sigma</td>
<td>T4799</td>
<td>From porcine pancreas; 1 mg/ml</td>
</tr>
<tr>
<td>Hyaluronidase</td>
<td>Reagent</td>
<td>Sigma</td>
<td>H 3884</td>
<td>200 mg/ml</td>
</tr>
<tr>
<td>DNase I</td>
<td>Reagent</td>
<td>Roche</td>
<td>1 284 932</td>
<td>10 mg/ml</td>
</tr>
<tr>
<td>EDTA</td>
<td>Reagent</td>
<td>Sigma</td>
<td>E 6511</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Silicone solution</td>
<td>Reagent</td>
<td>Serva</td>
<td>35130</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Paraformaldehyde (PFA)</td>
<td>Reagent</td>
<td>Sigma</td>
<td>P6148</td>
<td>8% PFA in 0.1M phosphate buffer (pH 7.4).</td>
</tr>
<tr>
<td>4',6-diamidino-2-phenylindole dihydrochloride</td>
<td>Reagent</td>
<td>Sigma</td>
<td>D 0542</td>
<td>DAPI</td>
</tr>
<tr>
<td>Fluorescent Mounting Medium</td>
<td>Reagent</td>
<td>Dako</td>
<td>S3023</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>BrDU</td>
<td>Reagent</td>
<td>Sigma</td>
<td>B 9285</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>96-well plates</td>
<td>Tool</td>
<td>FALCON</td>
<td>3072</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>24-well plates</td>
<td>Tool</td>
<td>FALCON</td>
<td>3047</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Pasteur pipettes</td>
<td>Tool</td>
<td>Brand</td>
<td>747720</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Forceps DUMONT #5</td>
<td>Tool</td>
<td>Fine Science Tools</td>
<td>11252-30</td>
<td>bevelled very fine shanks (0.05 mm x 0.02 mm tip)</td>
</tr>
<tr>
<td>Forceps DUMONT #7</td>
<td>Tool</td>
<td>Fine Science Tools</td>
<td>11271-30</td>
<td>curved shanks (0.07 mm x 0.10 mm tip)</td>
</tr>
<tr>
<td>Spring scissors,straight, 8cm</td>
<td>Tool</td>
<td>Fine Science Tools</td>
<td>15000-00</td>
<td>fine, small straight blades</td>
</tr>
<tr>
<td>Standard scissors, straight, sharp/blunt </td>
<td>Tool</td>
<td>Fine Science Tools</td>
<td>14007-14</td>
<td>Use for decapitation or cervical dislocation</td>
</tr>
<tr>
<td>Eppendorf tubes</td>
<td>Tool</td>
<td>Eppendorf</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>2ml; round bottom for better precipitation of pellet during centrifugation /cytospin</td>
</tr>
<tr>
<td>Cooling centrifuge</td>
<td>Tool</td>
<td>Eppendorf</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Rotation shaker</td>
<td>Tool</td>
<td>CAT</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Cytospin</td>
<td>Tool</td>
<td>Thermo Scientific</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

in vivo-like organotypic murine retinal wholemount culture

Ablations ciblées de gènes et l&#39;analyse des modèles animaux est la stratégie classique pour s&#39;inscrire fonction spécifique du gène de la rétine. Toutefois, transgéniques, la rétine spécifiques ou conditionnelle des modèles de souris KO présentent souvent létalité précoce ou qui souffrent de malformations graves, empêchant une analyse au-delà embryonnaire ou postnatale premiers stades. Culture de cellules primaires est une alternative à étudier les effets de facteurs exogènes appliqués recombinante, la surexpression de gènes ou de siRNA inactivation génique à médiation dans un environnement contrôlé. Culture de cellules dissociées a l&#39;avantage que les signaux endogènes atteindre les cellules cibles sont réduites, facilitant ainsi l&#39;identification des effets exogènes déclenché après la manipulation pharmacologique. Toutefois, d&#39;importantes interactions entre cellules sont initialement détruits par la digestion enzymatique ou de dissociation mécanique, même si réagrégées cultures retinospheroid 1 sont utilisées. En revanche, les cultures organotypiques rétine wholemount fournir un système proche de la situation in vivo physiologiques avec des interactions neuronales et de connexions 2-5 encore préservée. Dans cet article nous proposons une vidéo démonstration étape par étape (1) de l&#39;établissement d&#39;in vivo-rétinienne, comme organotypiques cultures wholemount notamment particularités dissection de l&#39;embryon, postnatale et adulte yeux murin et (2) une procédure de dissociation et cytospin pour l&#39;analyse des neurones l&#39;apoptose et la prolifération des cellules rétiniennes chez échantillons entiers organotypiques, par exemple après la culture, en présence de facteurs exogène appliquée recombinantes.

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In vivo-like Organotypic Murine Retinal Wholemount Culture

Cet article vidéo démontre la mise en place de cultures organotypiques rétine wholemount et une procédure d&#39;analyse des cytospin effets induits de manière exogène. Organotypiques rétine cultures wholemount imiter la<em&gt; In vivo</em&gt; La situation et faciliter considérablement l&#39;accessibilité des rétines de souris pour les manipulations expérimentales en contournant les inconvénients de modèles animaux murins classiques.

In vivo-like organotypiques Culture Wholemount murin rétiniennes

Targeted ablations of genes and analysis of animal models is the classical strategy for enrolling specific retinal gene function. However, transgenic, ...

Research

JoVE Journal

Biology

In vivo-like Organotypic Murine Retinal Wholemount Culture

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Culture organotypique de Retina lapin adulte

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Recherche

Biologie

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L&#39;isolement et la culture primaire de cellules de foie de rat

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