Name: in vivo-like organotypic murine retinal wholemount culture
Uploaded: 2010-01-11T17:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about In vivo-like Organotypic Murine Retinal Wholemount Culture at JoVE.com

Författarna vill tacka E. de la Rosa och AI Valenciano för inledande hjälp med inrättandet av organotypic kulturer och U. Laub och U. Gerster för tekniskt stöd.

All utrustning och reagenser måste köpas steril eller behöver värme eller ånga steriliseras eller steriliseras med 70% EtOH. Författarna hävdar att experiment på djur har utförts i enlighet med Europeiska gemenskapernas direktiv (86/609/EEG) i enlighet med riktlinjerna av NIH angående skötsel och användning av djur för försöksändamål förfaranden och de regler som anges av Institutional Animal Skötsel och användning kommittén (IACUC) vid universitetet i Duisburg-Essen (Ty...

<ol>
	<li>Rieke, M., Gottwald, E., Weibezahn, K. -. F., Layer, P. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+reconstruction+in+3D-spheroids+from+rodent+retina+in+a+motion-free,+bioreactor-based+microstructure.">Tissue reconstruction in 3D-spheroids from rodent retina in a motion-free, bioreactor-based microstructure.</a> Lab. Chip. 8, 2006-2213 (2008).</li><li>Donovan, S. L., Dyer, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+and+square+wave+electroporation+of+retinal+explant+cultures.">Preparation and square wave electroporation of retinal explant cultures.</a> Nature Protocols. 1, 2710-2718 (2006).</li><li>Duenker, N., Valenciano, A. I., Franke, A., Hernandez-Sanchez, C., Dressel, R., Behrendt, M., de Pablo, F., Krieglstein, K., de la Rosa, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Balance+of+pro-apoptotic+transforming+growth+factor-beta+and+anti-apoptotic+insulin+effects+in+the+control+of+cell+death+in+the+postnatal+mouse+retina.">Balance of pro-apoptotic transforming growth factor-beta and anti-apoptotic insulin effects in the control of cell death in the postnatal mouse retina.</a> Eur. J. Neurosci. 22, 28-38 (2005).</li><li>Franke, A. G., Gubbe, C., Beier, M., Duenker, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transforming+growth+factors+beta+and+Bone+morphogenetic+proteins:+Cooperative+players+in+chick+and+murine+programmed+retinal+cell+death.">Transforming growth factors beta and Bone morphogenetic proteins: Cooperative players in chick and murine programmed retinal cell death.</a> J. Comp. Neurol. 495, 263-278 (2005).</li><li>de la Rosa, E. J., D&#237;az, B., De Pablo, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organoculture+of+the+chick+embryonic+neuroretina.">Organoculture of the chick embryonic neuroretina.</a> Curr. Top. Dev. Biol. 36, 133-144 (1998).</li><li>Dohle, D. S., Pasa, S. D., Gustmann, S., Laub, M., Wissler, J. H., Jennissen, H. P., Duenker, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chick+ex+ovo+culture+and+ex+ovo+CAM+assay:+How+it+really+works.">Chick ex ovo culture and ex ovo CAM assay: How it really works.</a> J Vis Exp. 32, (2009).</li></ol>

Fördelen med murina organotypic retinal wholemount kulturer 2-5 över dissociation, monolager, retinospheroid eller återexporteras aggregerade 3D ​​sfäroid kulturer 1 ligger i bevarandet av neuronala interaktioner och anslutningar, härma in vivo-situationen. I jämförelse med tidigare rapporter 2, ger vår video artikeln en ingående demonstration av de egenheter i enucleation av murina ögon och dissekering av näthinnor i olika utvecklingsstadier, inklusive borttagnin...

<!DOCTYPE html PUBLIC "-//W3C//DTD XHTML 1.0 Transitional//EN" "http://www.w3.org/TR/xhtml1/DTD/xhtml1-transitional.dtd">
<html xmlns="http://www.w3.org/1999/xhtml" xml:lang="en" lang="en">	
		
		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>Mice</td>
<td>Animal</td>
<td>Charles Rivers Laboratories</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Dissection microscope</td>
<td>Tool</td>
<td>ZEISS</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>PBS</td>
<td>Reagent</td>
<td>Sigma</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>PBS should be cold (&gt; 4&deg;C) and sterile</td>
</tr>
<tr>
<td>Dulbecco`s modified eagle`s medium / nutrient mixture F-12 Ham</td>
<td>Reagent</td>
<td>Sigma</td>
<td>D 8900</td>
<td>DMEM / F-12</td>
</tr>
<tr>
<td>Apo-transferin</td>
<td>Reagent</td>
<td>Sigma</td>
<td>T 1147</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Putrescin</td>
<td>Reagent</td>
<td>Sigma</td>
<td>P 5780</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Sodium selenite</td>
<td>Reagent</td>
<td>Sigma</td>
<td>S 9133</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Progesterone</td>
<td>Reagent</td>
<td>Sigma</td>
<td>P 6149</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Gentamicine</td>
<td>Reagent</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>L-Glutamine</td>
<td>Reagent</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>25030-024</td>
<td>200 mM (100X), liquid</td>
</tr>
<tr>
<td>Bovine serum albumine (BSA)</td>
<td>Reagent</td>
<td>Roth</td>
<td>8076.3</td>
<td>30 mg/ml</td>
</tr>
<tr>
<td>Collagenase</td>
<td>Reagent</td>
<td>Sigma</td>
<td>C 0773</td>
<td>200 U/ml</td>
</tr>
<tr>
<td>Trypsin</td>
<td>Reagent</td>
<td>Sigma</td>
<td>T4799</td>
<td>From porcine pancreas; 1 mg/ml</td>
</tr>
<tr>
<td>Hyaluronidase</td>
<td>Reagent</td>
<td>Sigma</td>
<td>H 3884</td>
<td>200 mg/ml</td>
</tr>
<tr>
<td>DNase I</td>
<td>Reagent</td>
<td>Roche</td>
<td>1 284 932</td>
<td>10 mg/ml</td>
</tr>
<tr>
<td>EDTA</td>
<td>Reagent</td>
<td>Sigma</td>
<td>E 6511</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Silicone solution</td>
<td>Reagent</td>
<td>Serva</td>
<td>35130</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Paraformaldehyde (PFA)</td>
<td>Reagent</td>
<td>Sigma</td>
<td>P6148</td>
<td>8% PFA in 0.1M phosphate buffer (pH 7.4).</td>
</tr>
<tr>
<td>4',6-diamidino-2-phenylindole dihydrochloride</td>
<td>Reagent</td>
<td>Sigma</td>
<td>D 0542</td>
<td>DAPI</td>
</tr>
<tr>
<td>Fluorescent Mounting Medium</td>
<td>Reagent</td>
<td>Dako</td>
<td>S3023</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>BrDU</td>
<td>Reagent</td>
<td>Sigma</td>
<td>B 9285</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>96-well plates</td>
<td>Tool</td>
<td>FALCON</td>
<td>3072</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>24-well plates</td>
<td>Tool</td>
<td>FALCON</td>
<td>3047</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Pasteur pipettes</td>
<td>Tool</td>
<td>Brand</td>
<td>747720</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Forceps DUMONT #5</td>
<td>Tool</td>
<td>Fine Science Tools</td>
<td>11252-30</td>
<td>bevelled very fine shanks (0.05 mm x 0.02 mm tip)</td>
</tr>
<tr>
<td>Forceps DUMONT #7</td>
<td>Tool</td>
<td>Fine Science Tools</td>
<td>11271-30</td>
<td>curved shanks (0.07 mm x 0.10 mm tip)</td>
</tr>
<tr>
<td>Spring scissors,straight, 8cm</td>
<td>Tool</td>
<td>Fine Science Tools</td>
<td>15000-00</td>
<td>fine, small straight blades</td>
</tr>
<tr>
<td>Standard scissors, straight, sharp/blunt </td>
<td>Tool</td>
<td>Fine Science Tools</td>
<td>14007-14</td>
<td>Use for decapitation or cervical dislocation</td>
</tr>
<tr>
<td>Eppendorf tubes</td>
<td>Tool</td>
<td>Eppendorf</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>2ml; round bottom for better precipitation of pellet during centrifugation /cytospin</td>
</tr>
<tr>
<td>Cooling centrifuge</td>
<td>Tool</td>
<td>Eppendorf</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Rotation shaker</td>
<td>Tool</td>
<td>CAT</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Cytospin</td>
<td>Tool</td>
<td>Thermo Scientific</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

in vivo-like organotypic murine retinal wholemount culture

Riktade ablationer av gener och analys av djurmodeller är den klassiska strategin för inskrivning specifika retinal geners funktion. Men transgena, näthinnan-specifika eller villkorlig knockout musmodeller visar ofta tidiga dödsfall eller lider av svåra missbildningar och förhindrar en analys bortom embryonala eller tidig postnatal stadier. Primära cellkulturer är ett alternativ att undersöka effekterna av exogent tillämpas rekombinanta faktorer, överuttryck av gener eller siRNA-medierad gen ÖVERVÄLDIGANDE i en kontrollerad miljö. Dissocierade cellodling har fördelen att den endogena signalerna når målet cellerna minskar, vilket underlättar identifieringen av exogent utlöst effekter efter farmakologisk manipulation. Dock är viktiga cell-cell interaktioner initialt förstörts genom enzymatisk spjälkning eller mekaniska dissociation, även om re-aggregerade retinospheroid kulturer 1 används. Däremot organotypic retinala wholemount kulturer tillhandahålla ett system nära den fysiologiska in vivo-situationen med neuronala kontakter och anslutningar fortfarande bevarade 2-5. I denna video artikeln ger vi en steg för steg demonstration av (1) upprättande av in vivo-liknande organotypic retinal wholemount kulturer inklusive dissektion egenheter av embryonala, postnatal och vuxna murina ögon och (2) en dissociation och cytospin förfarande för analys av neuronala apoptos och retinal cellproliferation i organotypic wholemounts, t.ex. efter kulturen i närvaro av exogent tillämpas rekombinanta faktorer.

Watch this Scientific Journal Video about In vivo-like Organotypic Murine Retinal Wholemount Culture at JoVE.com

In vivo-like Organotypic Murine Retinal Wholemount Culture

Denna video artikeln visar inrättandet av organotypic retinal wholemount kulturer och en cytospin förfarande för analys av exogent inducerade effekter. Organotypic näthinnan wholemount kulturer härma<em&gt; In vivo</em&gt; Situation och avsevärt underlätta tillgängligheten till murina näthinnor för experimentella manipulationer samtidigt som den kringgår nackdelarna med klassiska murina djurmodeller.

In vivo-liknande Organotypic Murine Retinal Wholemount Kultur

Targeted ablations of genes and analysis of animal models is the classical strategy for enrolling specific retinal gene function. However, transgenic, ...

Research

JoVE Journal

Biology

In vivo-like Organotypic Murine Retinal Wholemount Culture

Organotypic Culture of Adult Rabbit Retina

Organotypic kultur Adult Rabbit Retina

Organotypic culture systems of functional neural tissues are important tools in neurobiological research. Ideally, such a system should be compatible with ...

Organotypic Slice Culture of E18 Rat Brains

Organotypic Slice Kultur av E18 råttors hjärnor

Organotypic slice cultures from embryonic rodent brains are widely used to study brain development. While there are often advantages to an in-vivo system, ...

Whole-cell Recordings of Light Evoked Excitatory Synaptic Currents in the Retinal Slice

Helcells-Inspelningar av Ljus Evoked excitatoriska Synaptic strömmar i näthinnan Slice

We use the whole-cell patch clamp technique to study the synaptic circuitry that underlies visual information processing in the retina. In this video, we ...

Imaging Exocytosis in Retinal Bipolar Cells with TIRF Microscopy

Imaging exocytos i näthinnan bipolär Celler med TIRF Mikroskopi

Total internal reflectance fluorescence (TIRF) microscopy is a technique that allows the study of events happening at the cell membrane, by selective ...

Primary Culture and Plasmid Electroporation of the Murine Organ of Corti. 

Primär Kultur och Plasmid elektroporation av Murine organ Corti.

In all mammals, the sensory epithelium for audition is located along the spiraling organ of Corti that resides within the conch shaped cochlea of the ...

Phenotypic Analysis and Isolation of Murine Hematopoietic Stem Cells and Lineage-committed Progenitors

Fenotypisk analys och isoleringen av murina hematopoietiska stamceller och Linjen-bundna stamfäder

The bone marrow is the principal site where HSCs and more mature blood cells lineage progenitors reside and differentiate in an adult organism. HSCs ...

Isolation and Primary Culture of Rat Hepatic Cells

Isolering och Primär kultur av celler Rat Hepatiska

Primary hepatocyte culture is a valuable tool that has been extensively used in basic research of liver function, disease, pathophysiology, pharmacology ...

Optimized Protocol for Retinal Wholemount Preparation for Imaging and Immunohistochemistry

Optimerad Protokoll för Retinal Wholemount Förberedelse för Imaging och Immunohistokemi

Working with delicate tissue can be a complicating factor when performing immunohistochemical assessment. Here, we present a method that utilizes a ...

MicroRNA Expression Profiles of Human iPS Cells, Retinal Pigment Epithelium Derived From iPS, and Fetal Retinal Pigment Epithelium

MikroRNA Expression Profiler av Human iPS-celler, pigmentepitelet härledas från iPS, och Fetal pigmentepitelet

The objective of this report is to describe the protocols for comparing the microRNA (miRNA) profiles of human induced-pluripotent stem (iPS) cells, ...

Measurement of Energy Metabolism in Explanted Retinal Tissue Using Extracellular Flux Analysis

Mätning av energimetabolism i explanterad retinala vävnaden med hjälp av extracellulära Flux analys

High acuity vision is a heavily energy-consuming process, and the retina has developed several unique adaptations to precisely meet such demands while ...