Name: measuring diffusion coefficients via two-photon fluorescence recovery after photobleaching
Uploaded: 2010-02-26T16:45:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Measuring Diffusion Coefficients via Two-photon Fluorescence Recovery After Photobleaching at JoVE.com

<p class="jove_content"> Dit werk werd gefinancierd door het Ministerie van Defensie Era of Hope Scholar Award (No. W81XWH-05-0396) en een Pew Scholar in de Biomedische Wetenschappen Award uit aan Edward B. Brown III. </p>

<p class="jove_title"> 1. Lijn de optiek. </p><p class="jove_content"> De sleutel apparatuur voor een MP-FRAP experiment zijn onder meer: ​​een mode-locked laserbron, Pockels Cell (voor beam modulatie), puls generator, dichroïsche, objectief, fluorescentie-emissie filter, gated fotomultiplicatorbuis, en een data-opname-systeem (foton tegen te gaan en multichannel scaler). </p><p class="jove_title"> 2. Vast te stellen veilig te controleren bevoegdheden. </p><ol><li> Het verkleinen van de laser op een lage, maar redelijke, macht voor het gen...

<ol>
	<li>Denk, W., Strickler, J. H., Webb, W. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two-photon+laser+scanning+fluorescence+microscopy.">Two-photon laser scanning fluorescence microscopy.</a> <em style='font-style: italic'>Biophys J</em>. <b>60</b>, 73-76 (1990).</li><li>Brown, E. B., Wu, E. S., Zipfel, W., Webb, W. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measurement+of+molecular+diffusion+in+solution+by+multiphoton+fluorescence+photobleaching+recovery.">Measurement of molecular diffusion in solution by multiphoton fluorescence photobleaching recovery.</a> <em style='font-style: italic'>Biophys J</em>. <b>77</b>, 2837-2849 (1999).</li><li>Sullivan, K. D., Sipprell, W. H. B. r. o. w. n., Jr, E. B., Brown, E. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+model+of+fluorescence+recovery+expands+the+application+of+multiphoton+fluorescence+recover+after+photobleaching+in+vivo.">Improved model of fluorescence recovery expands the application of multiphoton fluorescence recover after photobleaching in vivo.</a> <em style='font-style: italic'>Biophys J</em>. <b>96</b>, 5082-5094 (2009).</li></ol>

<p class="jove_content"> De kracht van multi-foton fluorescentie herstel na fotobleken ligt in zijn vermogen om dikke stalen sonde met 3D-resolutie. Sinds de ontwikkeling in de jaren 1990, heeft MP-FRAP is gebruikt om de diffusiecoëfficiënt (of analoge transport parameters) te bepalen in cellichamen, <em>ex vivo</em> dikke plakken weefsel, en <em>in vivo</em> weefsel en interstitium. In dit artikel presenteerden wij de apparatuur die nodig is om een ​​MP-FRAP experiment, evenals de juiste procedure voor het uitlijnen van de stralengang ru...

<!DOCTYPE html PUBLIC "-//W3C//DTD XHTML 1.0 Transitional//EN" "http://www.w3.org/TR/xhtml1/DTD/xhtml1-transitional.dtd">
<html xmlns="http://www.w3.org/1999/xhtml" xml:lang="en" lang="en">	
		
		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>Ti:sapphire laser</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Spectra Physics</td>
<td>Mai Tai</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Pockels Cell</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Conoptics</td>
<td>350-80</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Laser Scanning Microscope</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Olympus</td>
<td>Fluoview</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Short pass dichroic mirror</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Chroma Technologies</td>
<td>670 DCSX-2P</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Photomultiplier tube</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Hamamatsu</td>
<td>HC125-02</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Photon counter</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Stanford Research Systems</td>
<td>SR 400</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Multi-channel scaler/averager</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Stanford Research Systems</td>
<td>SR 430</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Pulse Generator</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Stanford Research Systems</td>
<td>DG 535</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>FITC-BSA</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>--</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>
	

measuring diffusion coefficients via two-photon fluorescence recovery after photobleaching

<p class="jove_content">Multi-fluorescentie herstel na fotobleken is een microscopie techniek die gebruikt wordt om de diffusiecoëfficiënt (of analoge transport parameters) van macromoleculen te meten, en kan worden toegepast op zowel<em&gt; In vitro</em&gt; En<em&gt; In vivo</em&gt; Biologische systemen. Multi-fluorescentie herstel na fotobleken wordt uitgevoerd door fotobleken een gebied van belang in een tl-monster met behulp van een intense laser flash, dan is het verminderen van de balk en het toezicht op de fluorescentie als nog-fluorescerende moleculen van buiten de regio van belang diffuse in de photobleached moleculen te vervangen . We beginnen onze demonstratie door het uitlijnen van de laserstraal door de Pockels Cell (laser modulator) en langs de optische pad door de laser scan-box en objectief naar het monster. Voor de eenvoud zullen we gebruik maken van een steekproef van waterige fluorescente kleurstof. Wij zullen dan bepalen de juiste experimentele parameters voor onze steekproef met inbegrip van, monitoren en bleken bevoegdheden, bleekmiddel duur, bak breedte (voor foton tellen), en fluorescentie hersteltijd. Vervolgens beschrijven we de procedure voor het nemen van herstel bochten, een proces dat grotendeels kan via LabVIEW (National Instruments, Austin, TX) geautomatiseerde voor een betere doorvoer. Ten slotte wordt de diffusie coëfficiënt bepaald door het aanbrengen van het herstel van gegevens aan de juiste wiskundig model met behulp van een kleinste-kwadraten fitting algoritme, gemakkelijk te programmeren met behulp van software zoals MATLAB (The Mathworks, Natick, MA).</p>

Watch this Scientific Journal Video about Measuring Diffusion Coefficients via Two-photon Fluorescence Recovery After Photobleaching at JoVE.com

Measuring Diffusion Coefficients via Two-photon Fluorescence Recovery After Photobleaching

<p class="jove_content">In dit artikel beschrijven we de procedure voor het meten van diffusiecoëfficiënten het gebruik van multi-foton fluorescentie herstel na fotobleken. We zullen beginnen met het uitlijnen van de laser langs de optische pad naar het monster en het bepalen van de juiste experimentele parameters, ga dan verder het genereren en tenslotte montage fluorescentie herstel curves.</p>

Het meten van diffusiecoëfficiënten via twee-foton Fluorescence Recovery After Photobleaching

Multi-fluorescence recovery after photobleaching is a microscopy technique used to measure the diffusion coefficient (or analogous transport parameters) ...

Research

JoVE Journal

Biology

Two-photon axotomy and time-lapse confocal imaging in live zebrafish embryos

Twee-foton axotomy en time-lapse confocale imaging in levende zebravis embryo&#39;s

Zebrafish have long been utilized to study the cellular and molecular mechanisms of development by time-lapse imaging of the living transparent embryo.  ...

Time-lapse Imaging of Mitosis After siRNA Transfection

Time-lapse Imaging van mitose Na siRNA transfectie

Changes in cellular organization and chromosome dynamics that occur during mitosis are tightly coordinated to ensure accurate inheritance of genomic and ...

Two-Photon-Based Photoactivation in Live Zebrafish Embryos

Twee-foton-Based Fotoactivatie in de Live zebravis embryo&#39;s

Photoactivation of target compounds in a living organism has proven a valuable approach to investigate various biological processes such as embryonic ...

<em>In vivo</em> Quantification of G Protein Coupled Receptor Interactions using Spectrally Resolved Two-photon Microscopy

In vivo Quantification of G Protein Coupled Receptor Interactions using Spectrally Resolved Two-photon Microscopy

<em>In vivo</em> Kwantificering van G-eiwit gekoppelde receptor interacties met behulp van spectraal Opgelost Twee-foton microscopie

The study of protein interactions in living cells is an important area of research because the information accumulated both benefits industrial ...

Photobleaching Assays (FRAP &amp; FLIP) to Measure Chromatin Protein Dynamics in Living Embryonic Stem Cells

Photobleaching Assays FRAP & FLIP to Measure Chromatin Protein Dynamics in Living Embryonic Stem Cells

Fotobleken Analyses (FRAP &amp; FLIP) om chromatine eiwit Dynamics Meet in Living Embryonale stamcellen

Fluorescence Recovery After Photobleaching (FRAP) and Fluorescence Loss In Photobleaching (FLIP) enable the study of protein dynamics in living cells with ...

Mapping Molecular Diffusion in the Plasma Membrane by Multiple-Target Tracing (MTT)

Mapping Molecular Diffusion in the Plasma Membrane by Multiple-Target Tracing MTT

Het in kaart brengen moleculaire diffusie in het plasmamembraan door Multiple-Target Tracing (MTT)

Our goal is to obtain a comprehensive description of molecular processes occurring at cellular membranes in different biological functions. We aim at ...

Easy Measurement of Diffusion Coefficients of EGFP-tagged Plasma Membrane Proteins Using k-Space Image Correlation Spectroscopy

Gemakkelijk Meting van diffusiecoëfficiënten van EGFP-gelabeld plasmamembraaneiwitten gebruik van K-Space Beeld Correlatie Spectroscopie

Lateral diffusion and compartmentalization of plasma membrane proteins are tightly regulated in cells and thus, studying these processes will reveal new ...

Recovery of Adult Zebrafish Hearts for High-throughput Applications

Herstel van de Adult zebravis Harten voor High-throughput Toepassingen

Use of the zebrafish model system for studying development, regeneration, and disease is expanding toward use of adult hearts for cell dissociation and ...

Two-photon Imaging of Intracellular Ca<sup>2+</sup> Handling and Nitric Oxide Production in Endothelial and Smooth Muscle Cells of an Isolated Rat Aorta

Two-photon Imaging of Intracellular Ca2+ Handling and Nitric Oxide Production in Endothelial and Smooth Muscle Cells of an Isolated Rat Aorta

Twee-foton Imaging van intracellulaire Ca<sup&gt; 2+</sup&gt; Behandeling en stikstofoxide productie in endotheelcellen en gladde spiercellen van een geïsoleerd Rat Aorta

Calcium is a very important regulator of many physiological processes in vascular tissues. Most endothelial and smooth muscle functions highly depend on ...

Measuring DNA Damage and Repair in Mouse Splenocytes After Chronic <em>In Vivo</em> Exposure to Very Low Doses of Beta- and Gamma-Radiation

Measuring DNA Damage and Repair in Mouse Splenocytes After Chronic In Vivo Exposure to Very Low Doses of Beta- and Gamma-Radiation

Het meten van DNA-schade en herstel in Mouse Splenocyten Na Chronische<em&gt; In Vivo</em&gt; Blootstelling aan zeer lage doses van bèta en gamma-straling

Low dose radiation exposure may produce a variety of biological effects that are different in quantity and quality from the effects produced by high ...