Name: measuring diffusion coefficients via two-photon fluorescence recovery after photobleaching
Uploaded: 2010-02-26T16:45:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Measuring Diffusion Coefficients via Two-photon Fluorescence Recovery After Photobleaching at JoVE.com

Este trabajo fue financiado por el Departamento de Defensa de la concesión era de esperanza Scholar (N º W81XWH-05-0396) y una beca Pew en el Premio de Ciencias Biomédicas de Edward B. Brown III.

1. Alinear la óptica. El equipo esencial de un experimento MP-FRAP son: un modo bloqueado fuente de láser, células Pockels (por haz de modulación), generador de impulsos, dicroicos, las lentes objetivo, la fluorescencia de emisión de filtro, tubo fotomultiplicador cerrada, y un sistema de registro de datos (fotones contra y multicanal escalador). 2. Determinará las competencias segura monitor. <ol><li> Atenuar el láser a un mínimo, pero razonable, para la...

<ol>
	<li>Denk, W., Strickler, J. H., Webb, W. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two-photon+laser+scanning+fluorescence+microscopy.">Two-photon laser scanning fluorescence microscopy.</a> Biophys J. 60, 73-76 (1990).</li><li>Brown, E. B., Wu, E. S., Zipfel, W., Webb, W. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measurement+of+molecular+diffusion+in+solution+by+multiphoton+fluorescence+photobleaching+recovery.">Measurement of molecular diffusion in solution by multiphoton fluorescence photobleaching recovery.</a> Biophys J. 77, 2837-2849 (1999).</li><li>Sullivan, K. D., Sipprell, W. H. B. r. o. w. n., Jr, E. B., Brown, E. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+model+of+fluorescence+recovery+expands+the+application+of+multiphoton+fluorescence+recover+after+photobleaching+in+vivo.">Improved model of fluorescence recovery expands the application of multiphoton fluorescence recover after photobleaching in vivo.</a> Biophys J. 96, 5082-5094 (2009).</li></ol>

El poder de la multi-fotón recuperación de fluorescencia después de photobleaching radica en su capacidad de conseguir que las muestras de espesor con una resolución en 3D. Desde su desarrollo en la década de 1990, MP-FRAP se ha utilizado para determinar el coeficiente de difusión (o parámetros análogos de transporte) en los cuerpos celulares, ex rebanadas gruesas de tejido vivo, y en el tejido vivo y el intersticio. En este artículo, presentamos el equipo necesario para real...

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		<div>
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		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>Ti:sapphire laser</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Spectra Physics</td>
<td>Mai Tai</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Pockels Cell</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Conoptics</td>
<td>350-80</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Laser Scanning Microscope</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Olympus</td>
<td>Fluoview</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Short pass dichroic mirror</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Chroma Technologies</td>
<td>670 DCSX-2P</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Photomultiplier tube</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Hamamatsu</td>
<td>HC125-02</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Photon counter</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Stanford Research Systems</td>
<td>SR 400</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Multi-channel scaler/averager</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Stanford Research Systems</td>
<td>SR 430</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Pulse Generator</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Stanford Research Systems</td>
<td>DG 535</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>FITC-BSA</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>--</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

measuring diffusion coefficients via two-photon fluorescence recovery after photobleaching

Multi-fluorescencia de recuperación después de photobleaching es una técnica de microscopía para medir el coeficiente de difusión (o parámetros análogos de transporte) de las macromoléculas, y se puede aplicar tanto a<em&gt; In vitro</em&gt; Y<em&gt; In vivo</em&gt; Los sistemas biológicos. Multi-fluorescencia de recuperación después de photobleaching se lleva a cabo por photobleaching una región de interés dentro de una muestra fluorescente se utiliza un flash láser intensa, atenuar el haz y el control de la fluorescencia de las moléculas fluorescentes que aún fuera de la región de difusión de interés para reemplazar a las moléculas photobleached . Vamos a empezar nuestra demostración, alineando el haz de láser a través de la célula Pockels (modulador láser) ya lo largo del camino óptico a través del cuadro de escaneo láser y la lente de objetivo de la muestra. Para simplificar, vamos a utilizar una muestra de tinte fluorescente acuoso. A continuación, se determinan los parámetros adecuados para nuestra muestra experimental, incluyendo el seguimiento y los poderes de blanqueo, la duración de la lejía, anchos de caja (de conteo de fotones), y el tiempo de recuperación de fluorescencia. A continuación, se describe el procedimiento para la toma de curvas de recuperación, un proceso que se puede automatizar en gran medida a través de LabVIEW (National Instruments, Austin, TX) para un rendimiento mejorado. Finalmente, el coeficiente de difusión es determinado por la instalación de recuperación de datos para el modelo matemático adecuado utilizar un algoritmo de ajuste por mínimos cuadrados, fácilmente programable utilizando software como MATLAB (The Mathworks, Natick, MA).

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Measuring Diffusion Coefficients via Two-photon Fluorescence Recovery After Photobleaching

En este artículo vamos a describir el procedimiento para medir coeficientes de difusión con multi-fotón recuperación de fluorescencia después de photobleaching. Vamos a empezar por alinear el láser a lo largo del camino óptico de la muestra y la determinación de los parámetros experimentales adecuadas, y luego continuar la generación de curvas de fluorescencia y por último montaje de recuperación.

Medición de los coeficientes de difusión a través de dos fotones de fluorescencia de recuperación después de photobleaching

Multi-fluorescence recovery after photobleaching is a microscopy technique used to measure the diffusion coefficient (or analogous transport parameters) ...

Research

JoVE Journal

Biology

Two-photon axotomy and time-lapse confocal imaging in live zebrafish embryos

De dos fotones axotomía y de lapso de tiempo de imagen confocal en embriones de pez cebra en vivo

Zebrafish have long been utilized to study the cellular and molecular mechanisms of development by time-lapse imaging of the living transparent embryo.  ...

Investigación

Biología

Time-lapse Imaging of Mitosis After siRNA Transfection

Time-lapse de imágenes de mitosis después de la transfección de siRNA

Changes in cellular organization and chromosome dynamics that occur during mitosis are tightly coordinated to ensure accurate inheritance of genomic and ...

Two-Photon-Based Photoactivation in Live Zebrafish Embryos

De dos fotones basado en fotoactivación en vivo embriones de pez cebra

Photoactivation of target compounds in a living organism has proven a valuable approach to investigate various biological processes such as embryonic ...

In vivo Quantification of G Protein Coupled Receptor Interactions using Spectrally Resolved Two-photon Microscopy

In vivo Quantification of G Protein Coupled Receptor Interactions using Spectrally Resolved Two-photon Microscopy

En la cuantificación in vivo de interacciones de proteínas G del receptor acoplado con espectralmente resuelve de dos fotones de Microscopía

The study of protein interactions in living cells is an important area of research because the information accumulated both benefits industrial ...

Photobleaching Assays (FRAP &amp; FLIP) to Measure Chromatin Protein Dynamics in Living Embryonic Stem Cells

Photobleaching Assays FRAP & FLIP to Measure Chromatin Protein Dynamics in Living Embryonic Stem Cells

Photobleaching ensayos (FRAP y FLIP) para medir la dinámica de la cromatina de proteínas en células vivas madre embrionarias

Fluorescence Recovery After Photobleaching (FRAP) and Fluorescence Loss In Photobleaching (FLIP) enable the study of protein dynamics in living cells with ...

Mapping Molecular Diffusion in the Plasma Membrane by Multiple-Target Tracing (MTT)

Mapping Molecular Diffusion in the Plasma Membrane by Multiple-Target Tracing MTT

Cartografía de la difusión molecular en la membrana plasmática de objetivos múltiples de Búsquedas (MTT)

Our goal is to obtain a comprehensive description of molecular processes occurring at cellular membranes in different biological functions. We aim at ...

Easy Measurement of Diffusion Coefficients of EGFP-tagged Plasma Membrane Proteins Using k-Space Image Correlation Spectroscopy

Fácil Medición de Difusión Coeficientes de etiquetado-EGFP Plasma Proteínas de la Membrana Usando k-espacio Correlación Imagen Spectroscopy

Lateral diffusion and compartmentalization of plasma membrane proteins are tightly regulated in cells and thus, studying these processes will reveal new ...

Recovery of Adult Zebrafish Hearts for High-throughput Applications

Recuperación de adultos de pez cebra Corazones para aplicaciones de alto rendimiento

Use of the zebrafish model system for studying development, regeneration, and disease is expanding toward use of adult hearts for cell dissociation and ...

Two-photon Imaging of Intracellular Ca2+ Handling and Nitric Oxide Production in Endothelial and Smooth Muscle Cells of an Isolated Rat Aorta

Two-photon Imaging of Intracellular Ca2+ Handling and Nitric Oxide Production in Endothelial and Smooth Muscle Cells of an Isolated Rat Aorta

De dos fotones de imágenes de Ca intracelular<sup&gt; 2 +</sup&gt; Manejo y producción de óxido nítrico en el endotelio y las células del músculo liso de la aorta de rata aislada

Calcium is a very important regulator of many physiological processes in vascular tissues. Most endothelial and smooth muscle functions highly depend on ...

Measuring DNA Damage and Repair in Mouse Splenocytes After Chronic In Vivo Exposure to Very Low Doses of Beta- and Gamma-Radiation

Measuring DNA Damage and Repair in Mouse Splenocytes After Chronic In Vivo Exposure to Very Low Doses of Beta- and Gamma-Radiation

Medición de daños y reparación del ADN en esplenocitos de ratón Después crónica<em&gt; En Vivo</em&gt; La exposición a dosis muy bajas de beta y gamma Radiación

Low dose radiation exposure may produce a variety of biological effects that are different in quantity and quality from the effects produced by high ...