Name: measuring diffusion coefficients via two-photon fluorescence recovery after photobleaching
Uploaded: 2010-02-26T16:45:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Measuring Diffusion Coefficients via Two-photon Fluorescence Recovery After Photobleaching at JoVE.com

<p class="jove_content"> Detta arbete har finansierats av ett försvarsdepartementet era av hopp Scholar Award (nr W81XWH-05-0396) och en Pew Scholar i biomedicin Award till Edward B. Brown III. </p>

<p class="jove_title"> 1. Rikta in optik. </p><p class="jove_content"> Den viktigaste utrustningen för en MP-FRAP experiment är: en modlåsta laserkälla, Pockelscell (för balk modulering), pulsgivare, dikroiskt, objektiv, fluorescens utsläpp filter, gated fotomultiplikatorn rör och ett registreringssystem (photon räknare och flerkanals scaler). </p><p class="jove_title"> 2. Bestäm säker övervaka befogenheter. </p><ol><li> Dämpa laser för att en låg men rimlig, makt för att generera fluorescens i provet. </li><li> Fokus i provet. <...

<ol>
	<li>Denk, W., Strickler, J. H., Webb, W. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two-photon+laser+scanning+fluorescence+microscopy.">Two-photon laser scanning fluorescence microscopy.</a> <em style='font-style: italic'>Biophys J</em>. <b>60</b>, 73-76 (1990).</li><li>Brown, E. B., Wu, E. S., Zipfel, W., Webb, W. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measurement+of+molecular+diffusion+in+solution+by+multiphoton+fluorescence+photobleaching+recovery.">Measurement of molecular diffusion in solution by multiphoton fluorescence photobleaching recovery.</a> <em style='font-style: italic'>Biophys J</em>. <b>77</b>, 2837-2849 (1999).</li><li>Sullivan, K. D., Sipprell, W. H. B. r. o. w. n., Jr, E. B., Brown, E. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+model+of+fluorescence+recovery+expands+the+application+of+multiphoton+fluorescence+recover+after+photobleaching+in+vivo.">Improved model of fluorescence recovery expands the application of multiphoton fluorescence recover after photobleaching in vivo.</a> <em style='font-style: italic'>Biophys J</em>. <b>96</b>, 5082-5094 (2009).</li></ol>

<p class="jove_content"> Kraften i flera foton fluorescens återhämtning efter fotoblekning ligger i dess förmåga att söka tjocka prover med 3D-upplösning. Sedan dess utveckling under 1990-talet, har MP-FRAP använts för att bestämma diffusionskoefficient (eller liknande transporter parametrar) i cell organ, <em>ex vivo</em> tjocka skivor vävnad och <em>in vivo</em> vävnad och interstitium. I denna artikel presenterade vi den utrustning som krävs för att köra en MP-FRAP experiment, liksom korrekt förfarande för anpassning av strå...

<!DOCTYPE html PUBLIC "-//W3C//DTD XHTML 1.0 Transitional//EN" "http://www.w3.org/TR/xhtml1/DTD/xhtml1-transitional.dtd">
<html xmlns="http://www.w3.org/1999/xhtml" xml:lang="en" lang="en">	
		
		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>Ti:sapphire laser</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Spectra Physics</td>
<td>Mai Tai</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Pockels Cell</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Conoptics</td>
<td>350-80</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Laser Scanning Microscope</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Olympus</td>
<td>Fluoview</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Short pass dichroic mirror</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Chroma Technologies</td>
<td>670 DCSX-2P</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Photomultiplier tube</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Hamamatsu</td>
<td>HC125-02</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Photon counter</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Stanford Research Systems</td>
<td>SR 400</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Multi-channel scaler/averager</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Stanford Research Systems</td>
<td>SR 430</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Pulse Generator</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Stanford Research Systems</td>
<td>DG 535</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>FITC-BSA</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>--</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>
	

measuring diffusion coefficients via two-photon fluorescence recovery after photobleaching

<p class="jove_content">Multi-fluorescens återhämtning efter fotoblekning är en mikroskopi teknik som används för att mäta diffusionskoefficient (eller motsvarande transport parametrar) av makromolekyler, och kan tillämpas på både<em&gt; In vitro</em&gt; Och<em&gt; In vivo</em&gt; Biologiska system. Multi-fluorescens återhämtning efter fotoblekning utförs av fotoblekning en region av intresse inom ett fluorescerande prov med hjälp av en intensiv laser blixt, sedan dämpa balken och övervakning av den fluorescens som alltjämt fluorescerande molekyler från utanför regionen av intresse diffusa att ersätta photobleached molekylerna . Vi börjar vår demonstration genom att rikta laserstrålen genom Pockelscell (laser-modulator) och längs den optiska vägen genom Laser Scan rutan och objektiv till provet. För enkelhetens skull kommer vi att använda ett urval av vattenbaserade fluorescerande färg. Vi kommer då att bestämma lämplig experimentella parametrar för vårt urval, inklusive, övervaka och blekning befogenheter, blekmedel längd, bredd bin (för foton räkna) och fluorescens återhämtningstid. Därefter kommer vi att beskriva förfarandet vid återhämtning kurvor, en process som kan till stor del automatiserad via LabVIEW (National Instruments, Austin, TX) för ökad genomströmning. Slutligen är diffusion koefficient bestämd av montering återhämtningen data till lämpliga matematiska modellen med minsta-kvadrat passande algoritm, lätt programmerbar med hjälp av programvara såsom Matlab (The MathWorks, Natick, MA).</p>

Watch this Scientific Journal Video about Measuring Diffusion Coefficients via Two-photon Fluorescence Recovery After Photobleaching at JoVE.com

Measuring Diffusion Coefficients via Two-photon Fluorescence Recovery After Photobleaching

<p class="jove_content">I denna artikel kommer vi att beskriva förfarandet för mätning diffusion koefficienter med hjälp av flera foton fluorescens återhämtning efter fotoblekning. Vi börjar med att rikta lasern längs den optiska väglängden till provet och fastställande av lämplig experimentella parametrar, då fortsätta att generera och slutligen montering fluorescens kurvor återhämtning.</p>

Mätning Diffusion Koefficienter via två-photon fluorescens återhämtning efter fotoblekning

Multi-fluorescence recovery after photobleaching is a microscopy technique used to measure the diffusion coefficient (or analogous transport parameters) ...

Research

JoVE Journal

Biology

Two-photon axotomy and time-lapse confocal imaging in live zebrafish embryos

Två-foton axotomy och Time-lapse konfokala imaging i levande zebrafisk embryon

Zebrafish have long been utilized to study the cellular and molecular mechanisms of development by time-lapse imaging of the living transparent embryo.  ...

Time-lapse Imaging of Mitosis After siRNA Transfection

Time-lapse avbildning av Mitos Efter siRNA Transfektion

Changes in cellular organization and chromosome dynamics that occur during mitosis are tightly coordinated to ensure accurate inheritance of genomic and ...

Two-Photon-Based Photoactivation in Live Zebrafish Embryos

Två-foton-Based Fotoaktiveringen i Live Zebrafish embryon

Photoactivation of target compounds in a living organism has proven a valuable approach to investigate various biological processes such as embryonic ...

<em>In vivo</em> Quantification of G Protein Coupled Receptor Interactions using Spectrally Resolved Two-photon Microscopy

In vivo Quantification of G Protein Coupled Receptor Interactions using Spectrally Resolved Two-photon Microscopy

<em>In vivo</em> Kvantifiering av G Tillsammans Interaktioner protein receptor med spektralt korrigerats inom två-photon Mikroskopi

The study of protein interactions in living cells is an important area of research because the information accumulated both benefits industrial ...

Photobleaching Assays (FRAP &amp; FLIP) to Measure Chromatin Protein Dynamics in Living Embryonic Stem Cells

Photobleaching Assays FRAP & FLIP to Measure Chromatin Protein Dynamics in Living Embryonic Stem Cells

Fotoblekning tester (FRAP &amp; Flip) för att mäta Chromatin Protein Dynamics i Living embryonala stamceller

Fluorescence Recovery After Photobleaching (FRAP) and Fluorescence Loss In Photobleaching (FLIP) enable the study of protein dynamics in living cells with ...

Mapping Molecular Diffusion in the Plasma Membrane by Multiple-Target Tracing (MTT)

Mapping Molecular Diffusion in the Plasma Membrane by Multiple-Target Tracing MTT

Kartläggning molekylär diffusion i plasmamembranet med Multiple-Target Tracing (MTT)

Our goal is to obtain a comprehensive description of molecular processes occurring at cellular membranes in different biological functions. We aim at ...

Easy Measurement of Diffusion Coefficients of EGFP-tagged Plasma Membrane Proteins Using k-Space Image Correlation Spectroscopy

Lätt Mätning av diffusionskoefficienter av EGFP-taggade Plasma membranproteiner Använda k-Space Bild korrelationsspektroskopi

Lateral diffusion and compartmentalization of plasma membrane proteins are tightly regulated in cells and thus, studying these processes will reveal new ...

Recovery of Adult Zebrafish Hearts for High-throughput Applications

Återvinning av vuxna zebrafisk Hjärtan för hög genomströmning Applications

Use of the zebrafish model system for studying development, regeneration, and disease is expanding toward use of adult hearts for cell dissociation and ...

Two-photon Imaging of Intracellular Ca<sup>2+</sup> Handling and Nitric Oxide Production in Endothelial and Smooth Muscle Cells of an Isolated Rat Aorta

Two-photon Imaging of Intracellular Ca2+ Handling and Nitric Oxide Production in Endothelial and Smooth Muscle Cells of an Isolated Rat Aorta

Två-foton Imaging av intracellulär Ca<sup&gt; 2+</sup&gt; Hantering och kväveoxidproduktion i Endothelial och glatta muskelceller av en isolerad råttaorta

Calcium is a very important regulator of many physiological processes in vascular tissues. Most endothelial and smooth muscle functions highly depend on ...

Measuring DNA Damage and Repair in Mouse Splenocytes After Chronic <em>In Vivo</em> Exposure to Very Low Doses of Beta- and Gamma-Radiation

Measuring DNA Damage and Repair in Mouse Splenocytes After Chronic In Vivo Exposure to Very Low Doses of Beta- and Gamma-Radiation

Att mäta DNA-skador och reparation i mussplenocyter Efter kronisk<em&gt; In Vivo</em&gt; Exponering för mycket låga doser av beta- och gamma-strålning

Low dose radiation exposure may produce a variety of biological effects that are different in quantity and quality from the effects produced by high ...