Name: platelet adhesion and aggregation under flow using microfluidic flow cells
Uploaded: 2009-10-27T07:00:00
Duration: 10 min 10 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Platelet Adhesion and Aggregation Under Flow using Microfluidic Flow Cells at JoVE.com

الجزء 1 : إعداد القنوات ميكروفلويديك لوحة BioFlux. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> قبل تشغيل التجربة الخلية التدفق ، واحد يحتاج إلى إعداد قنوات ميكروفلويديك مع طلاء البروتين من الفائدة. في هذه الحالة ، سوف يكون استعملت الكولاجين. كل قناة لها مدخل ومخرج بئر. لهذا الطبق ، ومدخل جيد اليسار تغذية جيدة القناة والمخرج جيدا هو على حق. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضعاف الكولاجين الأول (5mg/ml الأسهم) طلاء لتركيز حمض الخليك في 200μg/ml 0.02M. وسوف يحتاج المرء 20μl لكل قناة المستخدمة. مزيج لطيف من قبل triteration مع طرف micropipette. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 20 ميكروليتر من الطلاء على كل قناة منها لاستخدامه. يجب على المرء أن يستغني السائل الى لكمة الداخلية للمخرج التغذية جيدا قناة ميكروفلويديك من الاهتمام باستخدام micropipette. تجنب إدخال فقاعات ، لا دفع الهواء للخروج من ماصة. وتشمل قناة واحدة دون الكولاجين لمكافحة أي الكولاجين (أ السيطرة السلبية للالتصاق وتكدس). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إرفاق واجهة لوحة من قبل أول اصبع تشديد الخناق (4) ومرة ​​واحدة ثم هم كل مجموعة ، واستخدام برنامج تشغيل لتشديد عزم الدوران تماما. سيكون سائق عزم الدوران فوق عندما تصل إلى الحد الأقصى ضيق. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استخدام الوضع اليدوي في البرنامج BioFlux ، تطبيق الارواء إلى قنوات 2dyn/cm الفائدة عند 2 من مأخذ جيدا. هنا لا بد من مشاهدة لكمة الداخلية مقابل أن تكون مملوءة السائل. وسوف يستغرق ذلك عدة دقائق. يمكن للمرء أن يراقب إما أن يحدث هذا الهدف باستخدام الطاقة المنخفضة على المجهر (4X) وإيجاد مدخل البئر أو من خلال عقد لوحة ويبحث في آبار مدخل من أسفل. وينبغي للمرء أن يرى لأول مرة حبة صغيرة من السائل الذي يملأ ببطء لكمة الداخلية. بمجرد ملء كمة مدخل الداخلية ، ووقف نضح في آن واحد عن طريق دفع توقف في البرنامج. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> احتضان لوحة في درجة حرارة الغرفة لمدة ساعة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة واجهة وإضافة 1 مل من برنامج تلفزيوني (زائد كا 2 + / + 2 ملغ) إلى منفذ بشكل جيد. بدء نضح من مأخذ جيدا في 2dyn/cm 2. يستمر لمدة 10 دقيقة الارواء. نضح وقف وإزالة واجهة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة الزائدة من كلا PBS مدخل ومخرج الآبار -- أبدا إزالة السائل الذي يملأ لكمة الداخلية. كتلة القنوات باستخدام حل حجب (0.5 ٪ V / V جيش صرب البوسنة في برنامج تلفزيوني (زائد كا 2 + / + 2 ملغ)). إضافة 1 مل من محلول حظر على كل منفذ جيد لاستخدامها ويروي من مأخذ جيدا في 2dyn/cm 2. يستمر لمدة 10 دقيقة الارواء. نضح وقف وإزالة واجهة. ويمكن استخدام القنوات استعداد يصل إلى هذه الخطوة على مدار اليوم. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> قبل إضافة الدم ، وإزالة السائل على جانبي القناة باستثناء اللكمات الداخلية. </li></ol> الجزء 2. إعداد الدم مع GPIIb / الثالث ألف الأضداد المثبطة. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> في حين أن الكولاجين هو تفرخ في القنوات ، لا بد من تحضير الدم الكامل. ينبغي للمرء أن نتبع تعليمات السلامة الإحيائية التي تمليها المعهد له / لها عند التعامل مع الدم البشري. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وينبغي استخدام الدم البشري الطازج (من شخص صائم) الانتباه الى تخثر سترات الصوديوم في غضون 3 ساعات من جمعها. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحضير الدم عن طريق إضافة calcein 4μM AM. يعد من الأسهم 4mM calcein صباحا في DMSO وإضافة إلى الدم في التخفيف من 1 / 1000 فولت / V. مزيج لطيف من خلال انقلاب. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الاستغناء 1 مل من الدم calcein AM المسمى في 10 -- 1.5mL microtubes. إضافة GPIIb / الثالث ألف مثبط على كل الأضداد في التخفيف المطلوب (الوزن الجزيئي للمفتش الحكومة هو ~ 150kDa). ومثال على ذلك هو سلسلة التخفيف من 1200nM ل9nM ويتضمن الضد السيطرة والتحكم لا علاقة لها الضد. عنصر تحكم ممتازة إيجابية لتثبيط ستكون الذي يدخل (abciximab ، ايلي ليللي) في تركيز 20ug/ml. ميكس بواسطة انعكاس لطيف. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يحضن في درجة حرارة الغرفة لمدة 1 ساعة. مزيج لطيف من قبل انعكاس كل 10 دقائق. </li></ol> الجزء 3 : تشغيل تجربة خلية تدفق على محطة العمل BF1000. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> أولا ، لا بد من إعداد بروتوكول الآلي في وحدة التحكم BioFlux. لالكولاجين الأول ، ينبغي للمرء أن إعداد بروتوكول لتشغيل 10dyn/cm 2 لمدة 10 دقائق من مأخذ جيدا. عند هذه النقطة ، ينبغي لأحد أن أيضا إعداد المعلمات الحصول على البيانات باستخدام محطة BF1000 ، بما في ذلك المناصب القناة ، في التقاط الموجة FITC والمعلومات مرور الزمن. فمن المستحسن أن القبض على 3 مجالات عرضها باستخدام هدفا لكل قناة 10X كل 30 ثانية خلال مدة 10 دقائق المجموع. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> العمل بسرعة ، ومكان 500ul الدم أعد كل حالة استعداد إلى قنوات منفصلة. مكان لا دم السيطرة الضد الى القناة التي هي المغلفة مع الكولاجين واحد فقط التي يتم حظرها. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع لوحة على واجهة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع لوحة على محطة العمل BF1000 المجهر. المشبك على الواجهة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تنفيذ لوحة التكيف تحميل. كذلك ، نقل مرحلة واحدة تحتوي على الدم جيدا. مجموعة FTمعلمات IC التقاط الصور (زمن التعرض ، الخ... كسب). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> في برنامج المونتاج BioFlux ، بدء لبدء تدفق اقتناء وحيازة واحد. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة لوحة من BF1000 محطة العمل ، والتخلص من لوحة وفقا للمبادئ التوجيهية المؤسسية. </li></ol> الجزء 4 : النتائج الممثل. هنا تم تقديم التصاق الصفائح الدموية للبروتوكول والتجميع في قنوات ميكروفلويديك. المعاملة مع مثبط تراكم الصفائح الدموية ، كما أدرج anti-GPIIb/IIIa في البروتوكول. الكولاجين باستخدام قنوات ميكروفلويديك المغلفة للنظام BioFlux ، ينبغي للمرء أن يتوقع أن يشهدوا تشكيل خثرة العدوانية على مر الزمن مع عينة الدم غير المعالجة ومراقبة أي تشكيل خثرة على قناة غير المصقول. في تجربة واحدة أجريت في الآونة الأخيرة ، وكان متوسط ​​حجم الركام في ظل ظروف السيطرة 2000μm 2. الشكل 1. <img src="/files/ftp_upload/1644/1644fig1.jpg" alt="الشكل 1" /> تنشيط GPIIb / الثالث ألف وسيط قوي من الصفائح الدموية للصفائح التفاعلات والاستقرار التجميع 1. الانضمام إلى مجمع ينشط الكولاجين GPIIb / الثالث ألف لانتزاع هذا الرد 2. بعد حضانة مع anti-GPIIb/IIIa لمدة 1 ساعة قبل التعرض القص ، وينبغي للمرء أن يتوقع أن نلاحظ انخفاضا في حجم الجلطة الدموية فضلا عن انخفاض في وتيرة تشكيل خثرة. ويمكن عادة ما تعتمد الاستجابة للجرعة يتعين مراعاتها في 10dyn/cm 2. الشكل 2. <img src="/files/ftp_upload/1644/1644fig2.jpg" alt="الشكل 2" /> كان 50 IC قيمة لهذا المانع سيما في 17nM DYN 10 / سم 2. وكان الحد الأقصى لتثبيط (لهذا المانحة) مقابل السيطرة الضد أي 11 ٪ في 10 DYN / سم 2. في حين عرضت هنا باستخدام أساليب محددة بروتين المصفوفة خارج الخلية ومثبط محددة من تراكم الصفائح الدموية ، والبروتوكول هو توسعة لطبقات الطلاء الأخرى ، وأنواع الخلايا الأخرى ، ومثبطات أخرى للفحوصات التصاق الخلية. المكونات الأساسية لنجاح مثل هذه التجارب هي تجنب فقاعات في القنوات ميكروفلويديك ، التخفيف الصحيح لجميع الكواشف منظفة في الصحيح ، والظروف الملائمة لاحتضان جميع الكواشف.

<ol>
	<li>Jackson, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+growing+complexity+of+platelet+aggregation.">The growing complexity of platelet aggregation.</a> Blood. 109, 5087-5095 (2007).</li><li>Nakamura, T., Kambayashi, J., Okuma, M., Tandon, N. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activation+of+the+GP+IIb-IIIa+complex+induced+by+platelet+adhesion+to+collagen+is+mediated+by+both+alpha2beta1+integrin+and+GP.">Activation of the GP IIb-IIIa complex induced by platelet adhesion to collagen is mediated by both alpha2beta1 integrin and GP.</a> VI. J Biol Chem. 274, 11897-11903 (1999).</li></ol>

الكتاب المساهمة هم موظفون من العلوم البيولوجية الجريان.

في حين عرضت هنا باستخدام أساليب محددة بروتين المصفوفة خارج الخلية ومثبط محددة من تراكم الصفائح الدموية ، والبروتوكول هو توسعة لطبقات الطلاء الأخرى ، وأنواع الخلايا الأخرى ، ومثبطات أخرى للفحوصات التصاق الخلية. المكونات الأساسية لنجاح مثل هذه التجارب هي تجنب فقاعات في القنوات ميكروفلويديك ، التخفيف الصحيح لجميع الكواشف منظفة في الصحيح ، والظروف الملائمة لاحتضان جميع الكواشف.

<!DOCTYPE html PUBLIC "-//W3C//DTD XHTML 1.0 Transitional//EN" "http://www.w3.org/TR/xhtml1/DTD/xhtml1-transitional.dtd">
<html xmlns="http://www.w3.org/1999/xhtml" xml:lang="en" lang="en">	
		
		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>collagen I, Bovine</td>
<td>Reagent</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>A1064401</td>
<td>other sources of collagen I can be used</td>
</tr>
<tr>
<td>PBS plus Ca/Mg</td>
<td>Reagent</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>14040-117</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Bovine serum albumin (BSA)</td>
<td>Reagent</td>
<td>EMD</td>
<td>EM-2930 Bottom of Form</td>
<td>From VWR</td>
</tr>
<tr>
<td>calcein AM</td>
<td>Reagent</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>C1430</td>
<td>Calcein AM from BD can also be used</td>
</tr>
<tr>
<td>BioFlux 1000 System</td>
<td>Reagent</td>
<td>Fluxion Biosciences</td>
<td>Contact Company</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>BioFlux Plate</td>
<td>Reagent</td>
<td>Fluxion Biosciences</td>
<td>900013</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>antiGPIIb/IIIa</td>
<td>Reagent</td>
<td>Abcam</td>
<td>ab33407</td>
<td>an alternative # is ab15021</td>
</tr>
<tr>
<td>ReoPro</td>
<td>Reagent</td>
<td>Eli Lilly</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>by Rx only</td>
</tr>		</tbody>
		</table>
		</div>

platelet adhesion and aggregation under flow using microfluidic flow cells

يحدث تراكم الصفائح الدموية في استجابة لإصابة الأوعية الدموية حيث تعرضت المصفوفة خارج الخلية تحت البطانة. التصاق الصفائح الدموية في تتالي يحدث في وجود تدفق القص ، وهو عامل لا تحتسب في المقايسات التقليدية جيدا لوحة (ثابتة). هذه المقالة على تقارير الفحص الصفيحات التجميع ، وذلك باستخدام لوحة ميكروفلويديك جيدا تنسيق لمحاكاة الظروف الفسيولوجية تدفق القص. تترسب البروتينات خارج الخلية ، والكولاجين الأول أو عامل فون ويلبراند داخل القناة ميكروفلويديك به نضح نشطة مع مضخة هوائية. ثم تغسل مع البروتينات المصفوفة العازلة وسدت لإعداد قناة ميكروفلويديك للتفاعل الصفيحات. هو الدم الكامل perfused المسمى مع صبغة الفلورسنت من خلال القناة في معدلات تدفق مختلفة من أجل تحقيق تنشيط الصفائح الدموية وتجميعها. يمكن إضافة مثبطات تكدس الصفيحات قبل تدفق التجربة الخلية لتوليد البيانات IC50 الاستجابة للجرعة.

Watch this Scientific Journal Video about Platelet Adhesion and Aggregation Under Flow using Microfluidic Flow Cells at JoVE.com

Platelet Adhesion and Aggregation Under Flow using Microfluidic Flow Cells

التصاق الصفائح الدموية في تتالي يحدث في وجود تدفق القص ، وهو عامل لا تحتسب في المقايسات التقليدية جيدا لوحة (ثابتة). هذه المقالة على تقارير الفحص الصفيحات التجميع ، وذلك باستخدام لوحة ميكروفلويديك جيدا تنسيق لمحاكاة الظروف الفسيولوجية تدفق القص.

التصاق وتكدس الصفيحات تحت التدفق باستخدام خلايا تدفق ميكروفلويديك

Platelet aggregation occurs in response to vascular injury where the extracellular matrix below the endothelium has been exposed. The platelet adhesion ...

Research

JoVE Journal

Biology

Flow Cytometry Purification of Mouse Meiotic Cells

تدفق تنقية الخلوي للخلايا الفأر الانتصافي

The heterogeneous nature of cell types in the testis and the absence of meiotic cell culture models have been significant hurdles to the study of the ...

Optimized Staining and Proliferation Modeling Methods for Cell Division Monitoring using Cell Tracking Dyes

الأمثل أساليب النمذجة وتلوين لرصد انتشار استخدام الأصباغ انقسام الخلية خلية تتبع

Fluorescent cell tracking dyes, in combination with flow and image cytometry, are powerful tools with which to study the interactions and fates of ...

4D Imaging of Protein Aggregation in Live Cells

4D التصوير التجميع البروتين في الخلايا الحية

One of the key tasks of any living cell is maintaining the proper folding of newly synthesized proteins in the face of ever-changing environmental ...

Measuring Intracellular Ca2+ Changes in Human Sperm using Four Techniques: Conventional Fluorometry, Stopped Flow Fluorometry, Flow Cytometry and Single Cell Imaging

Measuring Intracellular Ca2+ Changes in Human Sperm using Four Techniques: Conventional Fluorometry, Stopped Flow Fluorometry, Flow Cytometry and Single Cell Imaging

قياس الكالسيوم داخل الخلايا<sup&gt; 2 +</sup&gt; التغييرات في الحيوانات المنوية البشرية باستخدام تقنيات أربعة: قياس التألق التقليدية، وتوقفت قياس التألق التدفق، التدفق الخلوي والتصوير خلية واحدة

Spermatozoa  are male reproductive cells especially designed to reach, recognize and fuse  with the egg. To perform these tasks, sperm cells must be ...

In Vitro Aggregation Assays Using Hyperphosphorylated Tau Protein

In Vitro Aggregation Assays Using Hyperphosphorylated Tau Protein

في المختبر تجميع فحوصات عن طريق Hyperphosphorylated تاو البروتين

Alzheimer's disease is one of a large group of neurodegenerative disorders known as tauopathies that are manifested by the neuronal deposits of ...

Reduced-gravity Environment Hardware Demonstrations of a Prototype Miniaturized Flow Cytometer and Companion Microfluidic Mixing Technology

انخفاض الجاذبية المظاهرات الأجهزة البيئة في نموذج المنمنمة تدفق عداد الكريات ورفيق ميكروفلويديك تقنية خلط

Until recently, astronaut blood samples were collected in-flight, transported to earth on the Space Shuttle, and analyzed in terrestrial laboratories. If ...

Cytosolic Calcium Measurements in Renal Epithelial Cells by Flow Cytometry

قياس الكالسيوم عصاري خلوي في الخلايا الظهارية الكلوية بواسطة التدفق الخلوي

A variety of cellular processes, both physiological and pathophysiological, require or are governed by calcium, including exocytosis, mitochondrial ...

LED Thermo Flow &#8212; Combining Optogenetics with Flow Cytometry

LED Thermo Flow ÃƒÆ’Ã‚Â¢ÃƒÂ¢Ã¢â‚¬Å¡Ã‚Â¬ÃƒÂ¢Ã¢â€šÂ¬Ã‚Â Combining Optogenetics with Flow Cytometry

LED الحرارية تدفق - الجمع بين علم البصريات الوراثي مع التدفق الخلوي

Optogenetic tools allow isolated, functional investigations of almost any signaling molecule within complex signaling pathways. A major obstacle is the ...

Analysis of Cell Suspensions Isolated from Solid Tissues by Spectral Flow Cytometry

تحليل معلقات خلية معزولة من الأنسجة الصلبة من قبل الطيفي التدفق الخلوي

Flow cytometry has been used for the past 40 years to define and analyze the phenotype of lymphoid and other hematopoietic cells. Initially restricted to ...

Live-cell Imaging of Platelet Degranulation and Secretion Under Flow

تصوير الخلايا الحية من تحبيب الصفائح الدموية والإفراز تحت التدفق

Blood platelets are essential players in hemostasis, the formation of thrombi to seal vascular breaches. They are also involved in thrombosis, the ...