Name: platelet adhesion and aggregation under flow using microfluidic flow cells
Uploaded: 2009-10-27T07:00:00
Duration: 10 min 10 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Platelet Adhesion and Aggregation Under Flow using Microfluidic Flow Cells at JoVE.com

חלק 1: הכנת הערוצים microfluidic צלחת BioFlux. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לפני הפעלת הניסוי התא זרימה, צריך להכין את ערוצי microfluidic עם ציפוי חלבון של עניין. במקרה זה, קולגן אני ישמשו. כל ערוץ יש מפרצון ולשקע היטב. עבור צלחת זו, כניסת גם הוא עזב גם להאכיל את ערוץ ולשקע גם הוא בצד ימין. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לדלל את הקולגן אני (5mg/ml המלאי) ציפוי ריכוז 200μg/ml של חומצה אצטית 0.02M. אחת תצטרך 20μl לכל ערוץ בשימוש. מערבבים על ידי triteration עדין עם טיפ micropipette. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 20 μl של ציפוי על כל ערוץ בהתאמה לשמש. צריך לוותר הנוזל לתוך להקיש הפנימי של משקע גם להאכיל את ערוץ microfluidic עניין באמצעות micropipette. הימנע מציגה בועות, לא לדחוף את האוויר מתוך פיפטה. כלול ערוץ אחד ללא קולגן שליטה לא קולגן (שליטה שלילי הידבקות וצבירה). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חבר את ממשק הצלחת על ידי האצבע הראשונה הידוק 4 ברגים ואז כל פעם הם קבוצה, השתמש הנהג מומנט לחלוטין להדק. הנהג מומנט ילחצו כאשר הוא מגיע אטימות מירבית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שימוש במצב ידני בתוכנה BioFlux, להחיל זלוף לערוצים של ריבית 2dyn/cm 2-משקע היטב. כאן צריך להיזהר אגרוף הפנימי מול להתמלא בנוזל. זה ייקח כמה דקות. אפשר גם לראות את זה להתרחש באמצעות המטרה צריכת חשמל נמוכה על מיקרוסקופ (4X) ולמצוא את כניסת היטב או על ידי מחזיק את הצלחת להסתכל לתוך הבארות כניסת מלמטה. אחת צריך קודם לראות בטיפת נוזל לאט ממלא את האגרוף הפנימית. לאחר אגרוף הפנימי כניסת מלא, זלוף להפסיק בבת אחת על ידי לחיצה להפסיק בתוכנה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה את הצלחת בטמפרטורת החדר למשך שעה אחת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את הממשק ולהוסיף 1 מ&quot;ל של PBS (בתוספת Ca 2 + / Mg 2 +) לשקע היטב. התחל זלוף משקע היטב 2dyn/cm 2. המשך זלוף במשך 10 דקות. עצור זלוף ולהסיר את הממשק. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר PBS עודף כניסת והן בארות לשקע - אף פעם לא להסיר את נוזל הממלא את האגרוף הפנימית. חסום את הערוצים באמצעות פתרון חסימה (0.5% v / v BSA ב PBS (בתוספת Ca 2 + / Mg 2 +)). הוסף 1 מ&quot;ל של תמיסת חסימת לשקע כל טוב כדי לשמש perfuse משקע היטב 2dyn/cm 2. המשך זלוף במשך 10 דקות. עצור זלוף ולהסיר את הממשק. ערוצי מוכן עד שלב זה יכול לשמש לאורך כל היום. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לפני הוספת דם, להסיר את נוזל משני צדי הערוץ למעט אגרופים הפנימית. </li></ol> חלק 2. הכנת דם עם נוגדנים GPIIb / IIIa מעכבות. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעוד הקולגן הוא דוגרים בערוצים, חייבים להכין את כל הדם. אחד צריך לעקוב אחר תקנות biosafety מוכתב על ידי המכון שלו / שלה בעת הטיפול דם אדם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דם אדם טרי (מאדם בצום) להיגרר קרישה ציטרט הנתרן יש להשתמש בתוך 3 שעות של האוסף. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן דם על ידי הוספת calcein 4μM PM. הכינו מלאי של 4 מ&quot;מ calcein AM ב DMSO ולהוסיף דם דילול של 1 / 1000 v / נ מערבבים על ידי היפוך עדין. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לוותר על 1 מ&quot;ל של calcein AM שכותרתו דם לתוך 10 - 1.5mL microtubes. הוסף GPIIb / IIIa הנוגדן מעכב זה בדילול הרצוי (המשקל המולקולרי של IgG הוא ~ 150kDa). דוגמה לכך היא סדרת דילול מ 1200nM כדי 9nM וכולל בקרת אין נוגדנים ואת פקד הנוגדן קשור. לשלוט חיובי מצוין עיכוב יהיה ReoPro (abciximab, Eli Lilly) בריכוז של 20ug/ml. Mix ידי היפוך עדין. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה בטמפרטורת החדר למשך שעה 1. מערבבים על ידי היפוך עדין כל 10 דקות. </li></ol> חלק 3: הפעלת התא זרימה ניסוי בתחנת העבודה BF1000. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ראשית, יש להגדיר את פרוטוקול אוטומטי במודול הבקרה BioFlux. עבור קולגן אני, יש להגדיר פרוטוקול לרוץ 10dyn/cm 2 במשך 10 דקות משקע היטב. בשלב זה, צריך גם להגדיר פרמטרים נתונים הרכישה באמצעות תחנת BF1000, כולל עמדות הערוץ, לתפוס גל FITC ואת זמן לשגות מידע. מומלץ לתפוס 3 בתחומי להציג באמצעות מטרה 10x לערוץ כל 30 שניות על פני משך זמן של 10 דקות בסך הכל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עבודה במהירות, 500ul של דם מוכן של כל תנאי לאפיקים מוכן להפריד מקום. אין מקום דם מלאה נוגדנים לתוך ערוץ זה מצופה קולגן זו חסומה עתה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את ממשק על הצלחת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את הצלחת על המיקרוסקופ עבודה BF1000. קלאמפ על הממשק. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בצע התאמה עומס הצלחת. כמו כן, מהלך הבמה באר אחת המכילה דם. הגדר FTIC ללכוד תמונה הפרמטרים (זמן חשיפה וכו &#39;לזכות ...). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בתוכנה BioFlux מונטאז&#39;, להתחיל רכישת להתחיל לזרום ורכישת בו זמנית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את צלחת מתחנת עבודה BF1000, להיפטר צלחת בהתאם להנחיות מוסדיים. </li></ol> חלק 4: תוצאות נציג. הנה פרוטוקול של הידבקות אגרגציה של טסיות דם בערוצים microfluidic הוצג. טיפול מעכב אגרגציה של טסיות דם, anti-GPIIb/IIIa נכלל גם בפרוטוקול. באמצעות ערוצי קולגן מצופה microfluidic של מערכת BioFlux, יש לצפות היווצרות פקיק אגרסיבי לאורך זמן עם דגימת דם לא מטופל מלאה ללא היווצרות פקיק בערוץ ללא ציפוי. באחד הניסויים שבוצעו לאחרונה, הגודל הממוצע של אגרגטים בתנאים השליטה 2000μm 2. באיור 1. <img src="/files/ftp_upload/1644/1644fig1.jpg" alt="איור 1" /> הופעל GPIIb / IIIa הוא מתווך חזק של טסיות-טסיות אינטראקציות צבירה ייצוב 1. הדבקה על קולגן מפעיל את מורכבות GPIIb / IIIa לעורר את התגובה הזאת 2. לאחר הדגרה עם anti-GPIIb/IIIa שעה 1 לפני החשיפה גזירה, יש לצפות לצפות לירידה בגודל של thrombi כמו גם ירידה בשכיחות של היווצרות פקיק. התגובה תלויה במינון ניתן לבצע בדרך כלל שנצפה 10dyn/cm 2. איור 2. <img src="/files/ftp_upload/1644/1644fig2.jpg" alt="איור 2" /> הערך 50 IC עבור מעכב המסוים הזה היה 17nM ב 10 dyn / 2 ס&quot;מ. עיכוב מרבית (עבור התורם הזה) לעומת שליטה אין את הנוגדן היה 11% ב 10 dyn / 2 ס&quot;מ. בעוד שיטות כאן הוצגו באמצעות חלבון מסוים תאי מטריקס ו מעכב ספציפי של אגרגציה של טסיות דם, הפרוטוקול הוא להרחבה ציפויים אחרים, סוגי תאים אחרים מעכבי אחרים עבור מבחני הידבקות התא. המרכיבים המפתח להצלחה של ניסויים כאלה הימנעות בועות ערוצי microfluidic, דילול נכון של כל ריאגנטים ב diluents נכונה, תנאי הדגירה מתאים ריאגנטים בכלל.

<ol>
	<li>Jackson, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+growing+complexity+of+platelet+aggregation.">The growing complexity of platelet aggregation.</a> Blood. 109, 5087-5095 (2007).</li><li>Nakamura, T., Kambayashi, J., Okuma, M., Tandon, N. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activation+of+the+GP+IIb-IIIa+complex+induced+by+platelet+adhesion+to+collagen+is+mediated+by+both+alpha2beta1+integrin+and+GP.">Activation of the GP IIb-IIIa complex induced by platelet adhesion to collagen is mediated by both alpha2beta1 integrin and GP.</a> VI. J Biol Chem. 274, 11897-11903 (1999).</li></ol>

הכותבים הם עובדי תורם של Fluxion Biosciences.

בעוד שיטות כאן הוצגו באמצעות חלבון מסוים תאי מטריקס ו מעכב ספציפי של אגרגציה של טסיות דם, הפרוטוקול הוא להרחבה ציפויים אחרים, סוגי תאים אחרים מעכבי אחרים עבור מבחני הידבקות התא. המרכיבים המפתח להצלחה של ניסויים כאלה הימנעות בועות ערוצי microfluidic, דילול נכון של כל ריאגנטים ב diluents נכונה, תנאי הדגירה מתאים ריאגנטים בכלל.

<!DOCTYPE html PUBLIC "-//W3C//DTD XHTML 1.0 Transitional//EN" "http://www.w3.org/TR/xhtml1/DTD/xhtml1-transitional.dtd">
<html xmlns="http://www.w3.org/1999/xhtml" xml:lang="en" lang="en">	
		
		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>collagen I, Bovine</td>
<td>Reagent</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>A1064401</td>
<td>other sources of collagen I can be used</td>
</tr>
<tr>
<td>PBS plus Ca/Mg</td>
<td>Reagent</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>14040-117</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Bovine serum albumin (BSA)</td>
<td>Reagent</td>
<td>EMD</td>
<td>EM-2930 Bottom of Form</td>
<td>From VWR</td>
</tr>
<tr>
<td>calcein AM</td>
<td>Reagent</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>C1430</td>
<td>Calcein AM from BD can also be used</td>
</tr>
<tr>
<td>BioFlux 1000 System</td>
<td>Reagent</td>
<td>Fluxion Biosciences</td>
<td>Contact Company</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>BioFlux Plate</td>
<td>Reagent</td>
<td>Fluxion Biosciences</td>
<td>900013</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>antiGPIIb/IIIa</td>
<td>Reagent</td>
<td>Abcam</td>
<td>ab33407</td>
<td>an alternative # is ab15021</td>
</tr>
<tr>
<td>ReoPro</td>
<td>Reagent</td>
<td>Eli Lilly</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>by Rx only</td>
</tr>		</tbody>
		</table>
		</div>

platelet adhesion and aggregation under flow using microfluidic flow cells

צבירת טסיות דם מתרחשת בתגובה לפגיעה בכלי הדם שבו תאי מטריקס להלן האנדותל נחשף. מפל הידבקות טסיות מתקיים בנוכחות זרימה גזירה, גורם לא היוו ב קונבנציונאלי (סטטי) היטב הצלחת מבחני. מאמר זה מדווח על assay טסיות צבירה תוך שימוש בתבנית microfluidic צלחת היטב לחקות פיסיולוגי תנאי הזרימה גזירה. חלבונים תאיים, קולגן אני או גורם פון Willebrand מופקדים בתוך הערוץ microfluidic באמצעות זלוף פעיל עם משאבה פנאומטי. חלבונים מטריצה ​​נשטפים אז עם חיץ וחסמו להכין את הערוץ microfluidic עבור אינטראקציות הטסיות. דם שלם שכותרתו עם צבע פלואורסצנטי הוא perfused דרך ערוץ ברמות ספיקה שונים על מנת להשיג ההפעלה אגרגציה של טסיות דם. צבירה של מעכבי טסיות ניתן להוסיף לפני הניסוי תזרים התא לייצר IC50 בתגובה לנתונים מנה.

Watch this Scientific Journal Video about Platelet Adhesion and Aggregation Under Flow using Microfluidic Flow Cells at JoVE.com

Platelet Adhesion and Aggregation Under Flow using Microfluidic Flow Cells

מפל הידבקות טסיות מתקיים בנוכחות זרימה גזירה, גורם לא היוו ב קונבנציונאלי (סטטי) היטב הצלחת מבחני. מאמר זה מדווח על assay טסיות צבירה תוך שימוש בתבנית microfluidic צלחת היטב לחקות פיסיולוגי תנאי הזרימה גזירה.

הדבקה צבירת טסיות דם תחת זרימה באמצעות תאים תזרים Microfluidic

Platelet aggregation occurs in response to vascular injury where the extracellular matrix below the endothelium has been exposed. The platelet adhesion ...

Research

JoVE Journal

Biology

Flow Cytometry Purification of Mouse Meiotic Cells

Cytometry זרימה טיהור תאים עכבר meiotic

The heterogeneous nature of cell types in the testis and the absence of meiotic cell culture models have been significant hurdles to the study of the ...

Optimized Staining and Proliferation Modeling Methods for Cell Division Monitoring using Cell Tracking Dyes

אופטימיזציה שיטות דוגמנות מכתימה והפצת נשק לניטור חלוקת תא באמצעות צבעי מעקב סלולרי

Fluorescent cell tracking dyes, in combination with flow and image cytometry, are powerful tools with which to study the interactions and fates of ...

4D Imaging of Protein Aggregation in Live Cells

4D הדמיה של צבירת חלבון בתאים חיים

One of the key tasks of any living cell is maintaining the proper folding of newly synthesized proteins in the face of ever-changing environmental ...

Measuring Intracellular Ca2+ Changes in Human Sperm using Four Techniques: Conventional Fluorometry, Stopped Flow Fluorometry, Flow Cytometry and Single Cell Imaging

Measuring Intracellular Ca2+ Changes in Human Sperm using Four Techniques: Conventional Fluorometry, Stopped Flow Fluorometry, Flow Cytometry and Single Cell Imaging

מדידת תאיים Ca<sup&gt; 2 +</sup&gt; שינויים בזרע אנושי באמצעות ארבע טכניקות: fluorometry הקונבנציונלי, הפסיק fluorometry זרימה, cytometry זרימה והדמיה תא יחיד

Spermatozoa  are male reproductive cells especially designed to reach, recognize and fuse  with the egg. To perform these tasks, sperm cells must be ...

In Vitro Aggregation Assays Using Hyperphosphorylated Tau Protein

In Vitro Aggregation Assays Using Hyperphosphorylated Tau Protein

במבחני צבירת מבחנה באמצעות חלבון Hyperphosphorylated טאו

Alzheimer's disease is one of a large group of neurodegenerative disorders known as tauopathies that are manifested by the neuronal deposits of ...

Reduced-gravity Environment Hardware Demonstrations of a Prototype Miniaturized Flow Cytometer and Companion Microfluidic Mixing Technology

הפגנות חומרת הסביבה מופחתת כובד של טכנולוגיה cytometer זרימה וCompanion Microfluidic אב טיפוס מוקטנת ערבוב

Until recently, astronaut blood samples were collected in-flight, transported to earth on the Space Shuttle, and analyzed in terrestrial laboratories. If ...

Cytosolic Calcium Measurements in Renal Epithelial Cells by Flow Cytometry

מדידות סידן cytosolic בתאי האפיתל כליות על ידי cytometry הזרימה

A variety of cellular processes, both physiological and pathophysiological, require or are governed by calcium, including exocytosis, mitochondrial ...

LED Thermo Flow &#8212; Combining Optogenetics with Flow Cytometry

LED Thermo Flow ÃƒÆ’Ã‚Â¢ÃƒÂ¢Ã¢â‚¬Å¡Ã‚Â¬ÃƒÂ¢Ã¢â€šÂ¬Ã‚Â Combining Optogenetics with Flow Cytometry

LED Thermo Flow - שילוב Optogenetics עם cytometry זרימה

Optogenetic tools allow isolated, functional investigations of almost any signaling molecule within complex signaling pathways. A major obstacle is the ...

Analysis of Cell Suspensions Isolated from Solid Tissues by Spectral Flow Cytometry

ניתוח של המתלים תא מבודד מרקמות Solid ידי זרימת cytometry ספקטרלי

Flow cytometry has been used for the past 40 years to define and analyze the phenotype of lymphoid and other hematopoietic cells. Initially restricted to ...

Live-cell Imaging of Platelet Degranulation and Secretion Under Flow

Live-cell הדמיה של degranulation טסיות והפרשה תחת זרימה

Blood platelets are essential players in hemostasis, the formation of thrombi to seal vascular breaches. They are also involved in thrombosis, the ...