Name: platelet adhesion and aggregation under flow using microfluidic flow cells
Uploaded: 2009-10-27T07:00:00
Duration: 10 min 10 s
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Parte 1: Preparação dos canais microfluídicos de uma placa BioFlux. <ol><li> Antes de executar o experimento célula de fluxo, é preciso preparar os canais microfluídicos com uma camada de proteína de interesse. Neste caso, o colágeno I será utilizado. Cada canal tem uma entrada e uma saída bem. Para esta placa, a entrada também é a esquerda bem alimentar o canal ea saída está bem à direita. </li><li> Diluir o colágeno I revestimento (5mg/ml de ações) para a concentração 200μg/ml em ácido acético 0,02. Será necessário 20μl para cada canal utilizado. Misture por triteration gentil com uma ponta de micropipeta. </li><li> Adicionar 20 l de revestimento para cada canal respectivo para ser utilizado. Deve-se dispensar o líquido para dar um soco interior da tomada assim alimentar o canal de microfluídica de interesse usando uma micropipeta. Evitar a introdução de bolhas, não empurre o ar para fora da pipeta. Incluir um canal sem colágeno para um controle de colágeno não (controle negativo para a adesão e agregação). </li><li> Anexar a interface para a placa de primeiro dedo de apertar os 4 parafusos e, em seguida, uma vez que está tudo pronto, use o driver de torque para apertar completamente. O motorista torque vai clicar quando atinge a tensão máxima. </li><li> Usando o modo manual no software BioFlux, aplicar perfusão para os canais de interesse em 2dyn/cm 2-o da tomada também. Aqui é preciso prestar atenção para o soco oposto interior para ser preenchido com líquido. Isso levará alguns minutos. Um pode assistir a este ocorrer a partir da objetiva de baixa potência em um microscópio (4X) e encontrar a entrada de bem ou segurando o prato e olhando para os poços de entrada de baixo. Deve-se primeiro ver uma conta minúscula de líquido que enche lentamente o soco interior. Uma vez que o soco de entrada interior está cheio, pare de perfusão de uma só vez, empurrando parar no software. </li><li> Incubar a placa em temperatura ambiente por uma hora. </li><li> Remover a interface e adicionar 1 ml de PBS (mais Ca 2 + / Mg 2 +) para a saída bem. Iniciar a perfusão da tomada bem na 2dyn/cm 2. Continue perfusão por 10 minutos. Pare de perfusão e remover a interface. </li><li> Retire o excesso de PBS tanto de entrada e saída de poços - nunca remover o líquido que preenche o soco interior. Bloquear os canais utilizando solução de bloqueio (0,5% v / v BSA em PBS (mais Ca 2 + / Mg 2 +)). Adicionar 1 ml de solução de bloqueio para cada saída também para ser usado e perfundir da tomada bem na 2dyn/cm 2. Continue perfusão por 10 minutos. Pare de perfusão e remover a interface. Canais preparados até esta etapa pode ser usado durante todo o dia. </li><li> Antes de adicionar o sangue, remover o líquido em ambos os lados do canal, exceto para os socos interior. </li></ol> Parte 2. Preparando o sangue com GPIIb / IIIa de anticorpos inibidores. <ol><li> Enquanto que o colágeno é incubar nos canais, é preciso preparar o sangue total. Deve-se seguir as normas de biossegurança ditada por seu / sua instituto ao manipular sangue humano. </li><li> Sangue humano fresco (de um indivíduo em jejum), feita em anticoagulante citrato de sódio deve ser usado dentro de 3 horas após a coleta. </li><li> Prepare sangue adicionando calceína 4μM AM. Prepare um estoque 4mM de calceína AM em DMSO e adicionar sangue numa diluição de 1 / 1000 v / v. Misture por inversão suave. </li><li> Dispensar 1 ml da calceína AM rotulados de sangue em 10 - 1,5 ml microtubos. Adicionar GPIIb / IIIa anticorpo inibidor para cada na diluição desejada (o peso molecular de IgG é de ~ 150kDa). Uma série de diluição exemplo é de 1200nm para 9nM e inclui um controle de anticorpos não e um controle de anticorpos não relacionados. Um excelente controle positivo para a inibição seria ReoPro (abciximab, Eli Lilly) em uma concentração de 20ug/ml. Misture por inversão suave. </li><li> Incubar a temperatura ambiente por 1 hora. Misture por inversão suave a cada 10 minutos. </li></ol> Parte 3: A execução do experimento de célula de fluxo na estação de trabalho BF1000. <ol><li> Primeiro, é preciso estabelecer um protocolo automatizado no módulo de controle BioFlux. Para colágeno I, deve-se estabelecer um protocolo para executar 10dyn/cm 2 para 10 minutos da tomada também. Neste ponto, deve-se também configurar os parâmetros de aquisição de dados usando a estação de trabalho BF1000, incluindo posições de canal, captura em comprimento de onda FITC e lapso de tempo da informação. Recomenda-se a captura de três campos de vista usando uma objetiva de 10x por canal a cada 30 segundos sobre uma duração de 10 minutos no total. </li><li> Trabalhar rapidamente lugar, 500ul de sangue preparada de cada condição em separado canais preparados. Lugar nenhum sangue controle de anticorpos em um canal que é revestido com colágeno e um que é apenas bloqueado. </li><li> Lugar da interface na placa. </li><li> Coloque a placa no microscópio workstation BF1000. Grampo na interface. </li><li> Executar o ajuste de carga de placa. Além disso, mover palco para um sangue bem que o contém. Set FTImagem IC parâmetros de captura (tempo de exposição, etc ... ganham). </li><li> No software de montagem BioFlux, iniciar a aquisição de começar o fluxo e aquisição simultaneamente. </li><li> Retirar a placa da estação de trabalho BF1000, dispor de placa de acordo com as diretrizes institucionais. </li></ol> Parte 4: Resultados Representante. Aqui, o protocolo de adesão e agregação plaquetária em canais microfluídicos foi apresentado. Tratamento com um inibidor da agregação plaquetária, anti-GPIIb/IIIa também foi incluído no protocolo. Usando colágeno revestido canais microfluídicos do sistema BioFlux, deve-se esperar para ver a formação de trombos agressivo ao longo do tempo com a amostra não tratada de controle de sangue e não a formação de trombos no canal sem revestimento. Em um experimento realizado recentemente, o tamanho médio de agregados em condições de controle foi 2000μm 2. Figura 1. <img src="/files/ftp_upload/1644/1644fig1.jpg" alt="Figura 1" /> Ativado GPIIb / IIIa é potente mediador de plaquetas plaquetas interações e estabilização de agregação 1. Adesão ao colágeno ativa o complexo GPIIb / IIIa para obter esta resposta 2. Após a incubação com anti-GPIIb/IIIa por 1 hora antes da exposição ao cisalhamento, deve-se esperar para observar uma diminuição no tamanho dos trombos, assim como uma diminuição na freqüência de formação de trombos. Uma resposta dose-dependente geralmente pode ser observado em 10dyn/cm 2. Figura 2. <img src="/files/ftp_upload/1644/1644fig2.jpg" alt="Figura 2" /> O IC 50 valor para este inibidor específico foi 17nM a 10 dyn / cm 2. Inibição máxima (para o doador) em relação ao controle de nenhum anticorpo foi de 11% a 10 dyn / cm 2. Embora os métodos aqui foram apresentados usando uma proteína da matriz extracelular específica e um inibidor específico da agregação plaquetária, o protocolo é extensível a outros revestimentos, outros tipos de células e outros inibidores para ensaios de adesão celular. Os ingredientes chave para o sucesso de tais experiências são evitar bolhas nos canais microfluídicos, diluição correta de todos os reagentes na diluentes correta, e condições de incubação adequados para todos os reagentes.

<ol>
	<li>Jackson, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+growing+complexity+of+platelet+aggregation.">The growing complexity of platelet aggregation.</a> Blood. 109, 5087-5095 (2007).</li><li>Nakamura, T., Kambayashi, J., Okuma, M., Tandon, N. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activation+of+the+GP+IIb-IIIa+complex+induced+by+platelet+adhesion+to+collagen+is+mediated+by+both+alpha2beta1+integrin+and+GP.">Activation of the GP IIb-IIIa complex induced by platelet adhesion to collagen is mediated by both alpha2beta1 integrin and GP.</a> VI. J Biol Chem. 274, 11897-11903 (1999).</li></ol>

Os autores que contribuem são funcionários da Fluxion Biosciences.

Embora os métodos aqui foram apresentados usando uma proteína da matriz extracelular específica e um inibidor específico da agregação plaquetária, o protocolo é extensível a outros revestimentos, outros tipos de células e outros inibidores para ensaios de adesão celular. Os ingredientes chave para o sucesso de tais experiências são evitar bolhas nos canais microfluídicos, diluição correta de todos os reagentes na diluentes correta, e condições de incubação adequados para todos os reagentes.

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		<div>
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		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>collagen I, Bovine</td>
<td>Reagent</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>A1064401</td>
<td>other sources of collagen I can be used</td>
</tr>
<tr>
<td>PBS plus Ca/Mg</td>
<td>Reagent</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>14040-117</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Bovine serum albumin (BSA)</td>
<td>Reagent</td>
<td>EMD</td>
<td>EM-2930 Bottom of Form</td>
<td>From VWR</td>
</tr>
<tr>
<td>calcein AM</td>
<td>Reagent</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>C1430</td>
<td>Calcein AM from BD can also be used</td>
</tr>
<tr>
<td>BioFlux 1000 System</td>
<td>Reagent</td>
<td>Fluxion Biosciences</td>
<td>Contact Company</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>BioFlux Plate</td>
<td>Reagent</td>
<td>Fluxion Biosciences</td>
<td>900013</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>antiGPIIb/IIIa</td>
<td>Reagent</td>
<td>Abcam</td>
<td>ab33407</td>
<td>an alternative # is ab15021</td>
</tr>
<tr>
<td>ReoPro</td>
<td>Reagent</td>
<td>Eli Lilly</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>by Rx only</td>
</tr>		</tbody>
		</table>
		</div>

platelet adhesion and aggregation under flow using microfluidic flow cells

Agregação plaquetária ocorre em resposta à lesão vascular, onde a matriz extracelular abaixo do endotélio tem sido exposto. A cascata de adesão de plaquetas ocorre na presença de fluxo de cisalhamento, não um fator contabilizado em convencional (estática) bem-placa ensaios. Este artigo relata um ensaio de agregação plaquetária, utilizando um formato de prato bem-microfluídicos para emular condições fisiológicas do fluxo de cisalhamento. Proteínas extracelular, colágeno I ou fator de von Willebrand são depositados dentro do canal microfluídicos com uso de perfusão ativa, com uma bomba pneumática. As proteínas da matriz são, então, lavados com buffer e bloqueados para preparar o canal microfluídicos para interações de plaquetas. Sangue total marcada com corante fluorescente é perfundido através do canal em várias taxas de fluxo, a fim de conseguir a ativação e agregação plaquetária. Inibidores da agregação plaquetária pode ser adicionada antes do experimento célula de fluxo para gerar IC50 dados de resposta de dose.

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Platelet Adhesion and Aggregation Under Flow using Microfluidic Flow Cells

A cascata de adesão de plaquetas ocorre na presença de fluxo de cisalhamento, não um fator contabilizado em convencional (estática) bem-placa ensaios. Este artigo relata um ensaio de agregação plaquetária, utilizando um formato de prato bem-microfluídicos para emular condições fisiológicas do fluxo de cisalhamento.

Adesão e agregação plaquetária sob fluxo usando células de fluxo microfluídicos

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