Name: using the gene pulser mxcell electroporation system to transfect primary cells with high efficiency
Uploaded: 2010-01-07T00:00:00
Duration: 12 min 55 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Using the Gene Pulser MXcell Electroporation System to Transfect Primary Cells with High Efficiency at JoVE.com

1) celpreparaat <ol><li> Bij het gebruik van hechtende cellen, is het noodzakelijk om trypsinize en vóór het verzamelen van de cellen elektroporatie. </li><li> Te vergelijken transfectie van de vier muis embryonale fibroblasten (MEF) culturen, die drie verschillende passage nummers, voer dan de volgende op elke fles. </li><li> Aspireren uit celcultuur media. </li><li> Voeg PBS aan cellen te wassen. </li><li> Verwijder PBS, voeg voldoende trypsine aan cellen te dekken, en wacht een paar minuten zodat trypsine aan cellen los te maken. </li><li> Controleer kolven met een microscoop om de conditie van de cellen te controleren, smakken kolf met cellen los, en dan weer controleren fles om er zeker van cellen zijn allemaal vrijstaand. </li><li> Wacht extra tijd en herhaal indien nodig. </li><li> Als alle cellen zijn vrijstaand, toe te voegen serum bevattende media te trypsine te neutraliseren. </li><li> Overdracht cellen om een ​​centrifugebuis, en pellet-cellen door centrifugeren (RCF = 300 xg). </li><li> Verwijder supernatant en resuspendeer cellen in een bekend volume van de PBS. </li><li> Tellen cellen. </li><li> Transfer naar een nieuwe buis de juiste hoeveelheid celsuspensie aan het vereiste aantal van cellen voor experimenten (je zult 150 ul van cellen per well nodig bij een dichtheid van 1 x 10 6 cellen / ml) te geven. </li><li> Centrifuge cellen. </li><li> Verwijder supernatant en resuspendeer cellen in de juiste hoeveelheid van Gene Puiser elektroporatie buffer aan een cel dichtheid van 1 x 10 6 cellen / ml te bereiken. </li><li> Voeg 20 ug van plasmide per ml celsuspensie toe en meng voorzichtig. </li></ol> 2) Elektroporatie schip setup en elektroporatie Plaat opzet en elektroporatie <ol><li> Plug plaat kamer op de power module van de Gene Puiser MXcell elektroporatie systeem. </li><li> Pipetteer 150 ul cel mengsel of buffer in de putjes van een 96-wells plaat elektroporatie. </li><li> Leg plaat in plaat kamer en pols. </li><li> Verwijder de plaat uit kamer. </li><li> Meng goed door de inhoud en neer te pipetteren in elk putje. </li><li> Breng de cellen van elk putje naar voorverwarmde buffer in 12-wells platen. </li><li> Tik op plaat naar de cellen te verspreiden en het in incubator. </li><li> Laat cellen herstellen voor 24 uur. </li></ol> Kuvet setup en elektroporatie <ol start="9"><li> Haal de stekker plaat kamer van de power module van de Gene Puiser MXcell elektroporatie systeem en sluit de ShockPod ™ cuvette kamer. </li><li> Pipetteer 600 ul van celsuspensie in een 0,4 cm gat elektroporatie cuvette. </li><li> Zet cuvet in ShockPod kamer en leveren elektrische puls. </li><li> Verwijder de cuvet uit kamer. </li><li> Meng kuvet inhoud door en neer te pipetteren in de cuvette. </li><li> Breng de cellen van elk putje naar voorverwarmde buffer in 12-wells platen. </li><li> Tik op plaat naar de cellen te verspreiden en het in incubator. </li><li> Laat de cellen herstellen voor 24 uur. </li></ol> 3) representatieve resultaten Na het transfecteren cellen en om te herstellen, kwalitatief analyseren van de transfectie-efficiëntie, met behulp van epifluorescerende microscopie, en kwantitatief, met behulp van flow cytometrie. <img src="/files/ftp_upload/1662/1662fig1.jpg" alt="Figuur 1" /> Figuur 1. Cellen die met succes zijn geëlektroporeerd en zijn nu de uiting van de GFP-gen verschijnen onder epifluorescerende microscopie. <img src="/files/ftp_upload/1662/1662fig2.jpg" alt="Figuur 2" /> Figuur 2. Bekijken van de cellen onder fasecontrast maakt visualisatie van zowel de getransfecteerde en ongetransfecteerde cellen. Dit zijn de cellen die waren om de laagste spanning elektroporatie puls blootgesteld bij 200V. De cellen zijn grotendeels confluent wijten aan de hoge celdichtheid. <img src="/files/ftp_upload/1662/1662fig3.jpg" alt="Figuur 3" /> Figuur 3. Hetzelfde beeldveld onder epifluorescentie toont een aantal van de cellen zijn de uiting van de GFP marker, maar deze zijn slechts een klein percentage van de cellen zichtbaar is in de vorige afbeelding. <img src="/files/ftp_upload/1662/1662fig4.jpg" alt="Figuur 4" /> Figuur 4. Op 250V, het totale aantal levende cellen gezien onder fasecontrast daalt licht. <img src="/files/ftp_upload/1662/1662fig5.jpg" alt="Figuur 5" /> Figuur 5. Onder epifluorescentie, kan men zien dat het aantal GFP tot expressie brengen is toegenomen. <img src="/files/ftp_upload/1662/1662fig6.jpg" alt="Figuur 6" /> Figuur 6. Op het hoogste spanning, 375V, er zijn minder levende cellen zichtbaar. <img src="/files/ftp_upload/1662/1662fig7.jpg" alt="Figuur 7" /> Figuur 7. Echter, een groot percentage van de resterende cellen die GFP. Die voorwaarde is een optimale hangt af van het experimenteel ontwerp. In sommige experimenten het grootste aantal van de getransfecteerde cellen zou kunnen worden optimaal, in andere experimenten het hoogste percentage transfectie best zou kunnen zijn. Wij zijn geïnteresseerd in het percentage van cellen die GFP positieve onder elke conditie en hoe de percentages variëren met de cel leeftijd. Flowcytometrie kan kwantitatieve informatie over de transfectie resultaten onder elk van de verschillende elektroporatie voorwaarden. <img src="/files/ftp_upload/1662/1662fig8.jpg" alt="Figuur 8" /> Figuur 8. Hier is het percentage van de cellen die GFP positief in de passage 5 cellen onder elk van de 12 elektroporatie voorwaarden worden weergegeven. De maximale transfectie percentage was ongeveer 80% onder de hoogste spanning exponentiële verval pols, voorwaarde 6, en 70% onder de sterkste blokgolf getest, conditie 12. <img src="/files/ftp_upload/1662/1662fig9.jpg" alt="Figuur 9" /> Figuur 9. Met de cellen doorgegeven 9 keer voorafgaand aan de elektroporatie, het algemene patroon van de transfectie percentage is vrijwel identiek, maar met een zeer lichte daling in de transfectie percentages. <img src="/files/ftp_upload/1662/1662fig10.jpg" alt="Figuur 10" /> Figuur 10. Hier worden de percentages van GFP cellen in de passage 13 cellen die een duidelijke afname in transfectie percentage ten opzichte van de jongere cellen vertonen. De hoogste percentages transfectie werden ongeveer de helft van wat werd bereikt met de jongere cellen die het belang aantonen van het gebruik van gezonde cellen zo snel na isolatie mogelijk. <table border="1"><tbody><tr><td colspan="3"> Elektroporatie Voorwaarden voor transfecteren MEF cellen met behulp van de Gene Puiser MXcell </td></tr><tr><td> Voorwaarde (1-6) Exponentiële Decay pulsen, alle met 350 uF, 1000ohm </td><td> Spanning (V) </td><td></td></tr><tr><td> 1 </td><td> 200 </td><td></td></tr><tr><td> 2 </td><td> 250 </td><td></td></tr><tr><td> 3 </td><td> 300 </td><td></td></tr><tr><td> 4 </td><td> 326 </td><td></td></tr><tr><td> 5 </td><td> 350 </td><td></td></tr><tr><td> 6 </td><td> 376 </td><td></td></tr><tr><td> Voorwaarde (7-12) Vierkante Wave pulsen, alle met 2000 uF, 1000 ohm, en een puls </td><td> Spanning (V) </td><td> Pulsduur (ms) </td></tr><tr><td> 7 </td><td> 200 </td><td> 10 </td></tr><tr><td> 8 </td><td> 250 </td><td> 10 </td></tr><tr><td> 9 </td><td> 300 </td><td> 10 </td></tr><tr><td> 10 </td><td> 200 </td><td> 20 </td></tr><tr><td> 11 </td><td> 250 </td><td> 20 </td></tr><tr><td> 12 </td><td> 300 </td><td> 20 </td></tr></tbody></table>

De auteurs zijn in dienst van Bio-Rad Laboratories, dat reagentia en instrumenten die in dit artikel geeft

Deze video artikel legt uit hoe het MXcell elektroporatie systeem te gebruiken om gemakkelijk te identificeren optimale omstandigheden voor elektroporatie MEFs of andere primaire cellijnen. De 96-wells plaat-indeling kan voor vele herhalingen van experimentele of optimalisatie voorwaarden gelijktijdig worden uitgevoerd, die de noodzaak voor vele afzonderlijke experimenten kan elimineren. Bij de uitvoering van deze procedure, moet men aan te denken om gezonde cellen te gebruiken als snel na isolatie mogelijk en elektroporatie voorwaarden die zijn afgestemd op de elektroporatie buffer te gebruiken.

<!DOCTYPE html PUBLIC "-//W3C//DTD XHTML 1.0 Transitional//EN" "http://www.w3.org/TR/xhtml1/DTD/xhtml1-transitional.dtd">
<html xmlns="http://www.w3.org/1999/xhtml" xml:lang="en" lang="en">	
		
		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>Gene Pulser&reg; Electroporation Buffer</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Bio-Rad Laboratories, Inc.</td>
<td>165-2676</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Gene Pulser MXcell&trade; Electroporation System</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Bio-Rad Laboratories, Inc.</td>
<td>165-2670</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Gene Pulser MXcell&trade; ShockPod&trade; Cuvette Chamber</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Bio-Rad Laboratories, Inc.</td>
<td>165-2673</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Gene Pulser MXcell&trade; Electroporation System With ShockPod&trade; Cuvette Chamber</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Bio-Rad Laboratories, Inc.</td>
<td>165-2674</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

using the gene pulser mxcell electroporation system to transfect primary cells with high efficiency

Het wordt steeds duidelijker dat elektroporatie is de meest effectieve manier om plasmide DNA of siRNA introduceren in primaire cellen. De Gene Puiser MXcell elektroporatie systeem en Gene Puiser elektroporatie buffer (Bio-Rad) werden speciaal ontwikkeld om eenvoudig nucleïnezuren transfecteren in zoogdiercellen en moeilijk te transfecteren cellen, zoals de primaire en stamcellen. We zullen laten zien hoe je een eenvoudig experiment om snel de beste elektroporatie omstandigheden te vervullen. We zullen zien hoe verschillende monsters lopen door een waaier van elektroporatie condities, zodat een experiment kan worden uitgevoerd op hetzelfde moment als optimalisatie is uitgevoerd. We zullen ook zien hoe optimale omstandigheden geïdentificeerd 96-well platen met behulp van elektroporatie kan gebruikt worden met standaard elektroporatie cuvetten, het vergemakkelijken van de overstap van elektroporatie platen om elektroporatie cuvetten met behoud van dezelfde elektroporatie efficiëntie. In de video, zullen we ook bespreken een aantal van de belangrijkste factoren die kunnen leiden tot het succes of falen van elektroporatie experimenten.

Watch this Scientific Journal Video about Using the Gene Pulser MXcell Electroporation System to Transfect Primary Cells with High Efficiency at JoVE.com

Using the Gene Pulser MXcell Electroporation System to Transfect Primary Cells with High Efficiency (Video) | JoVE

Deze procedure laat zien hoe de Gene Puiser MXcell elektroporatie systeem te gebruiken om snel en gemakkelijk identificeren van de beste elektroporatie voorwaarden voor muis embryonale fibroblasten (MEF) of andere primaire cellen. Overwegingen voor het oplossen van problemen worden ook besproken in de bijbehorende video.

Met behulp van de Gene Puiser MXcell Elektroporatie systeem om primaire cellen transfecteren met een hoog rendement

It is becoming increasingly apparent that electroporation is the most effective way to introduce plasmid DNA or siRNA into primary cells. The Gene Pulser ...

Research

JoVE Journal

Biology

Using the Gene Pulser MXcell Electroporation System to Transfect Primary Cells with High Efficiency

Electroporation of Mycobacteria

Electroporation of Mycobacteria (Video) | JoVE

Elektroporatie van mycobacteriën

High efficiency transformation is a major limitation in the study of mycobacteria. The genus Mycobacterium can be difficult to transform; this is mainly ...

The Preparation of Primary Hematopoietic Cell Cultures From Murine Bone Marrow for Electroporation

The Preparation of Primary Hematopoietic Cell Cultures From Murine Bone Marrow for Electroporation (Video) | JoVE

De vervaardiging van primaire hematopoietische cellen culturen uit Murine Bone Marrow voor Elektroporatie

In utero and ex vivo Electroporation for Gene Expression in Mouse Retinal Ganglion Cells

In utero and ex vivo Electroporation for Gene Expression in Mouse Retinal Ganglion Cells (Video) | JoVE

In utero en ex vivo Elektroporatie voor Gene Expression Mouse in retinale ganglioncellen

The retina and its sole output neuron, the retinal ganglion cell (RGC), comprise an excellent model in which to examine biological questions such as cell ...

Primary Culture and Plasmid Electroporation of the Murine Organ of Corti. 

Primary Culture and Plasmid Electroporation of the Murine Organ of Corti. (Video) | JoVE

Primaire Cultuur en Plasmide Elektroporatie van de muizen orgaan van Corti.

In all mammals, the sensory epithelium for audition is located along the spiraling organ of Corti that resides within the conch shaped cochlea of the ...

Using an Automated Cell Counter to Simplify Gene Expression Studies: siRNA Knockdown of IL-4 Dependent Gene Expression in Namalwa Cells

Using an Automated Cell Counter to Simplify Gene Expression Studies: siRNA Knockdown of IL-4 Dependent Gene Expression in Namalwa Cells (Video) | JoVE

Met behulp van een geautomatiseerde cel Counter aan Gene Expression Studies Vereenvoudigen: siRNA Knockdown van IL-4 Afhankelijk van genexpressie in cellen Namalwa

The use of siRNA mediated gene knockdown is continuing to be an important tool in studies of gene expression.  siRNA studies are being conducted not only ...

Quantification of dsDNA using the Hitachi F-7000 Fluorescence Spectrophotometer and PicoGreen Dye

Quantification of dsDNA using the Hitachi F-7000 Fluorescence Spectrophotometer and PicoGreen Dye (Video) | JoVE

Kwantificering van dsDNA het gebruik van de Hitachi F-7000 fluorescentie Spectrophotometer en PicoGreen Dye

Quantification of DNA, especially in small concentrations, is an important task with a wide range of biological applications including standard molecular ...

siRNA Screening to Identify Ubiquitin and Ubiquitin-like System Regulators of Biological Pathways in Cultured Mammalian Cells

siRNA Screening to Identify Ubiquitin and Ubiquitin-like System Regulators of Biological Pathways in Cultured Mammalian Cells (Video) | JoVE

siRNA Screening naar Ubiquitin en Ubiquitin-achtig systeem regulatoren van biologische pathways identificeren in gekweekte zoogdiercellen

Post-translational modification of proteins with ubiquitin and ubiquitin-like molecules (UBLs) is emerging as a dynamic cellular signaling network that ...

Reverse Genetic Morpholino Approach Using Cardiac Ventricular Injection to Transfect Multiple Difficult-to-target Tissues in the Zebrafish Larva

Reverse Genetic Morpholino Approach Using Cardiac Ventricular Injection to Transfect Multiple Difficult-to-target Tissues in the Zebrafish Larva (Video) | JoVE

Reverse Genetische Morfolino benadering met behulp van de cardiale ventriculaire Injection naar meerdere Moeilijk-to-target weefsels in de zebravis Larve Transfecteren

The zebrafish is an important model to understand the cell and molecular biology of organ and appendage regeneration. However, molecular strategies to ...

High Efficiency Differentiation of Human Pluripotent Stem Cells to Cardiomyocytes and Characterization by Flow Cytometry

High Efficiency Differentiation of Human Pluripotent Stem Cells to Cardiomyocytes and Characterization by Flow Cytometry (Video) | JoVE

High Efficiency differentiatie van humane pluripotente stamcellen naar cardiomyocyten en karakterisering door flowcytometrie

There is an urgent need to develop approaches for repairing the damaged heart, discovering new therapeutic drugs that do not have toxic effects on the ...

High Content Screening Analysis to Evaluate the Toxicological Effects of Harmful and Potentially Harmful Constituents (HPHC)

High Content Screening Analysis to Evaluate the Toxicological Effects of Harmful and Potentially Harmful Constituents HPHC (Video) | JoVE

High Content Screening Analyse van de toxicologische effecten van schadelijke en potentieel schadelijke bestanddelen Evalueren (HPHC)

Cigarette smoke (CS) is a major risk factor for cardiovascular and lung diseases. Because CS is a complex aerosol containing more than 7,000 chemicals1 it ...