Name: using the gene pulser mxcell electroporation system to transfect primary cells with high efficiency
Uploaded: 2010-01-07T00:00:00
Duration: 12 min 55 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Using the Gene Pulser MXcell Electroporation System to Transfect Primary Cells with High Efficiency at JoVE.com

1) Zellpräparation <ol><li> Bei der Verwendung von anhaftenden Zellen, ist es notwendig, trypsinize und sammeln die Zellen vor der Elektroporation. </li><li> Zum Vergleich Transfektion unter den vier embryonalen Maus-Fibroblasten (MEF) Kulturen, die drei anderen Stelle Zahlen, gehen Sie wie folgt auf jeder Flasche. </li><li> Absaugen Zellkulturmedien. </li><li> Add PBS, um Zellen zu waschen. </li><li> Entfernen PBS; add ausreichend Trypsin, um Zellen bedecken und einige Minuten warten, damit Trypsin, um Zellen zu lösen. </li><li> Überprüfen Sie Flaschen mit einem Mikroskop, um den Zustand der Zellen zu überprüfen, smack Kolben auf Zellen zu trennen, und dann überprüfen Kolben erneut, um sicherzustellen Zellen sind alle gelöst. </li><li> Warten Sie zusätzlich Zeit und bei Bedarf wiederholen. </li><li> Wenn alle Zellen abgelöst werden, fügen Serum mit Medien Trypsin zu neutralisieren. </li><li> Transfer-Zellen in ein Zentrifugenröhrchen und Pellet-Zellen durch Zentrifugation (RZB = 300 xg). </li><li> Überstand entfernen und die Zellen in einem bekannten Volumen von PBS. </li><li> Zählen von Zellen. </li><li> Transfer in ein neues Röhrchen das entsprechende Volumen der Zellsuspension die erforderliche Anzahl von Zellen für Experimente (Sie werden 150 ul Zellen pro Vertiefung in einer Dichte von 1 x 10 6 Zellen / ml benötigen) liefern können. </li><li> Centrifuge Zellen. </li><li> Überstand entfernen und die Zellen in dem entsprechenden Volumen Gene Pulser Elektroporationspuffer auf eine Zelldichte von 1 x 10 6 Zellen / ml erreichen. </li><li> Add 20 ug von Plasmid pro ml Zellsuspension und vorsichtig mischen. </li></ol> 2) Die Elektroporation Schiff Setup und Elektroporation Platte Setup und Elektroporation <ol><li> Steckerplatte Kammer in den Leistungsteil des Gene Pulser MXcell Elektroporation System. </li><li> Je 150 ul Zellgemisch oder Puffer in die Vertiefungen einer 96-well Platte Elektroporation. </li><li> Legen Sie Platte in Platte Kammer und Puls. </li><li> Entfernen Platte aus der Kammer. </li><li> Gut mischen Inhalte durch Auf-und Abpipettieren in jede Vertiefung. </li><li> Übertragen Sie die Zellen aus jedem gut vorgewärmten Puffer in 12-Well-Platten. </li><li> Tippen Sie auf Teller verteilen Zellen und steckte es in Inkubator. </li><li> Lassen Zellen für 24 Stunden zu erholen. </li></ol> Cuvette Setup und Elektroporation <ol start="9"><li> Ziehen Sie Lamellenraum aus dem Leistungsteil des Gene Pulser MXcell Elektroporation System und stecken Sie den ShockPod ™ Küvette Kammer. </li><li> Pipette 600 ul Zellsuspension in ein 0,4 cm Abstand Elektroporationsküvette. </li><li> Put Küvette in ShockPod Kammer und liefern elektrischen Impuls. </li><li> Entfernen Küvette aus der Kammer. </li><li> Mix Küvette Inhalte durch Auf-und Abpipettieren in Küvette. </li><li> Übertragen Sie die Zellen aus jedem gut vorgewärmten Puffer in 12-Well-Platten. </li><li> Tippen Sie auf Teller verteilen Zellen und steckte es in Inkubator. </li><li> Lassen Sie die Zellen für 24 Stunden zu erholen. </li></ol> 3) repräsentative Ergebnisse Nach Transfektion von Zellen und erlaubt ihnen, Wiederherstellung, Analyse der Transfektionseffizienz qualitativ mit Epifluoreszenzmikroskopie und quantitativ mit Hilfe der Durchflusszytometrie. <img src="/files/ftp_upload/1662/1662fig1.jpg" alt="Abbildung 1" /> Abbildung 1. Cells, die erfolgreich elektroporiert und sind nun Ausdruck des GFP-Gens erscheinen unter Epifluoreszenzmikroskopie. <img src="/files/ftp_upload/1662/1662fig2.jpg" alt="Abbildung 2" /> Abbildung 2. Anzeigen der Zellen unter Phasenkontrast ermöglicht die Visualisierung der beiden transfizierten und nicht transfizierten Zellen. Dies sind die Zellen, die die niedrigste Spannung Elektroporation Puls bei 200 V ausgesetzt waren. Die Zellen sind weitgehend konfluenten aufgrund der hohen Zelldichte. <img src="/files/ftp_upload/1662/1662fig3.jpg" alt="Abbildung 3" /> Abbildung 3. Das gleiche Sichtfeld unter Epifluoreszenz zeigt eine Anzahl von Zellen sind Ausdruck der GFP-Marker, aber diese sind nur ein kleiner Prozentsatz der Zellen sichtbar in dem vorhergehenden Bild. <img src="/files/ftp_upload/1662/1662fig4.jpg" alt="Abbildung 4" /> Abbildung 4. Bei 250V, verringert sich die Gesamtzahl der lebenden Zellen unter Phasenkontrast gesehen leicht. <img src="/files/ftp_upload/1662/1662fig5.jpg" alt="Abbildung 5" /> Abbildung 5. Under Epifluoreszenz, kann man sehen, dass die Anzahl der GFP exprimierenden Zellen erhöht hat. <img src="/files/ftp_upload/1662/1662fig6.jpg" alt="Abbildung 6" /> Abbildung 6. Auf der höchsten Spannung, 375V, gibt es weniger lebende Zellen sichtbar. <img src="/files/ftp_upload/1662/1662fig7.jpg" alt="Abbildung 7" /> Abbildung 7. Allerdings sind ein Großteil der restlichen Zellen, die GFP. Welche Bedingung ist optimal, hängt von den experimentellen Design. In einigen Experimenten wurde die größte Anzahl an transfizierten Zellen könnte optimal sein, in anderen Experimenten der höchste Prozentsatz der Transfektion wohl am besten sein. Wir interessieren uns für den Prozentsatz an Zellen, die GFP positive unter jeder Bedingung und wie die Prozentsätze variieren mit Zell-Alter sind. Die Durchflusszytometrie kann liefern quantitative Information über die Transfektion Ergebnisse, die unter jedem der verschiedenen Elektroporation Bedingungen. <img src="/files/ftp_upload/1662/1662fig8.jpg" alt="Abbildung 8" /> Abbildung 8. Hier ist der Anteil der Zellen, die GFP positive in den Kanal 5 Zellen unter jedem der 12 Elektroporation Bedingungen gezeigt werden. Die maximale Transfektion Anteil von ca. 80% unter der höchsten Spannung exponentiellen Abfall Puls, Zustand 6, und 70% unter dem stärksten Rechteckimpuls getestet, Zustand 12. <img src="/files/ftp_upload/1662/1662fig9.jpg" alt="Abbildung 9" /> Abbildung 9. Mit der Zellen weitergegeben 9 Mal vor der Elektroporation, das allgemeine Muster der Transfektion Prozentsatz nahezu identisch ist, aber mit einem sehr leichten Rückgang der Transfektion Prozentsätze. <img src="/files/ftp_upload/1662/1662fig10.jpg" alt="Abbildung 10" /> Abbildung 10. Sehen Sie hier die Anteile der GFP-Zellen in der Passage 13 Zellen, die zu einem deutlichen Rückgang in der Transfektion Prozentsatz im Vergleich zu den jüngeren Zellen zeigen. Die höchsten Prozentsätze wurden Transfektion etwa die Hälfte, was mit den jüngeren Zellen demonstriert die Bedeutung der Verwendung gesunden Zellen so bald nach der Isolierung wie möglich erreicht. <table border="1"><tbody><tr><td colspan="3"> Elektroporation Bedingungen für die Transfektion von MEF-Zellen mit dem Gene Pulser MXcell verwendet </td></tr><tr><td> Zustand (1-6) Exponentiellen Abfall Impulse, alle mit 350 uF, 1000OHM </td><td> Spannung (V) </td><td></td></tr><tr><td> 1 </td><td> 200 </td><td></td></tr><tr><td> 2 </td><td> 250 </td><td></td></tr><tr><td> 3 </td><td> 300 </td><td></td></tr><tr><td> 4 </td><td> 326 </td><td></td></tr><tr><td> 5 </td><td> 350 </td><td></td></tr><tr><td> 6 </td><td> 376 </td><td></td></tr><tr><td> Condition (7-12) Rechteckimpulse, Alle mit 2000 uF, 1000 ohm, und 1 Impuls </td><td> Spannung (V) </td><td> Impulsdauer (ms) </td></tr><tr><td> 7 </td><td> 200 </td><td> 10 </td></tr><tr><td> 8 </td><td> 250 </td><td> 10 </td></tr><tr><td> 9 </td><td> 300 </td><td> 10 </td></tr><tr><td> 10 </td><td> 200 </td><td> 20 </td></tr><tr><td> 11 </td><td> 250 </td><td> 20 </td></tr><tr><td> 12 </td><td> 300 </td><td> 20 </td></tr></tbody></table>

Die Autoren werden von Bio-Rad Laboratories, die Reagenzien und Instrumente in diesem Artikel verwendet produziert beschäftigt

Dieses Video Artikel beschreibt, wie die MXcell Elektroporation System nutzen, um leicht zu identifizieren optimale Bedingungen für die Elektroporation MEFs oder andere primäre Zelllinien. Die 96-Well-Platte-Format ermöglicht für viele Wiederholungen der experimentellen oder Optimierung Bedingungen gleichzeitig durchgeführt werden, wodurch die Notwendigkeit für viele einzelne Experimente, beseitigen können. Während der Durchführung dieses Verfahrens, sollte man daran denken, gesunde Zellen so bald nach der Isolierung wie möglich zu nutzen und Elektroporation Bedingungen, die zur Elektroporationspuffer abgestimmt sind zu verwenden.

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<html xmlns="http://www.w3.org/1999/xhtml" xml:lang="en" lang="en">	
		
		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>Gene Pulser&reg; Electroporation Buffer</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Bio-Rad Laboratories, Inc.</td>
<td>165-2676</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Gene Pulser MXcell&trade; Electroporation System</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Bio-Rad Laboratories, Inc.</td>
<td>165-2670</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Gene Pulser MXcell&trade; ShockPod&trade; Cuvette Chamber</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Bio-Rad Laboratories, Inc.</td>
<td>165-2673</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Gene Pulser MXcell&trade; Electroporation System With ShockPod&trade; Cuvette Chamber</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Bio-Rad Laboratories, Inc.</td>
<td>165-2674</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

using the gene pulser mxcell electroporation system to transfect primary cells with high efficiency

Es wird immer deutlicher, dass die Elektroporation der effektivste Weg, um Plasmid-DNA oder siRNA in primären Zellen einzuführen. Die Gene Pulser MXcell Elektroporation und Gene Pulser Elektroporation Puffer (Bio-Rad) wurden speziell entwickelt, um leicht transfizieren Nukleinsäuren in Säugerzellen und schwer zu transfizieren Zellen, wie Primär-und Stammzellen. Wir werden zeigen, wie man ein einfaches Experiment, um schnell die besten Elektroporation Bedingungen durchzuführen. Wir werden zeigen, wie man mehrere Proben durch eine Reihe von Elektroporation Bedingungen, so dass ein Experiment zur gleichen Zeit wie die Optimierung durchgeführt wird, kann durchgeführt werden, laufen. Wir werden auch zeigen, wie optimale Bedingungen identifiziert mit 96-well Platten Elektroporation können mit Standard-Elektroporationsküvetten verwendet werden, erleichtert die Umstellung von Elektroporation Platten Elektroporationsküvetten unter Beibehaltung der gleichen Elektroporation Effizienz. In dem Video werden wir auch diskutieren einige der wichtigsten Faktoren, die zum Erfolg oder Misserfolg der Elektroporation Experimente führen kann.

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Using the Gene Pulser MXcell Electroporation System to Transfect Primary Cells with High Efficiency

Dieses Verfahren zeigt, wie die Gene Pulser MXcell Elektroporation System nutzen, um schnell und einfach identifizieren die besten Bedingungen für die Elektroporation embryonalen Maus-Fibroblasten (MEFs) oder andere Primärzellen. Überlegungen zur Fehlerbehebung sind auch in den zugehörigen Video diskutiert.

Mit dem Gene Pulser MXcell Elektroporation System zur Primary Cells mit hohem Wirkungsgrad zu transfizieren

It is becoming increasingly apparent that electroporation is the most effective way to introduce plasmid DNA or siRNA into primary cells. The Gene Pulser ...

Research

JoVE Journal

Biology

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High efficiency transformation is a major limitation in the study of mycobacteria. The genus Mycobacterium can be difficult to transform; this is mainly ...

Forschung

Biologie

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