Name: using the gene pulser mxcell electroporation system to transfect primary cells with high efficiency
Uploaded: 2010-01-07T00:00:00
Duration: 12 min 55 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Using the Gene Pulser MXcell Electroporation System to Transfect Primary Cells with High Efficiency at JoVE.com

1) תא הכנה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעת שימוש בתאי חסיד, יש צורך trypsinize לאסוף את התאים לפני electroporation. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי להשוות transfection בין ארבעת עובריים בעכבר פיברובלסטים (MEF) תרבויות, המייצג שלושה מספרים מעבר שונות, לבצע את הפעולות הבאות על כל בקבוק. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשאוב את תרבות התקשורת הסלולרי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף PBS לשטוף את התאים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר PBS; להוסיף טריפסין מספיק כדי לכסות תאים, לחכות כמה דקות כדי לאפשר טריפסין לנתק את התאים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בדוק צלוחיות עם מיקרוסקופ כדי לוודא את מצבם של התאים, הרואין בקבוק לנתק את התאים, ולאחר מכן לבדוק שוב בקבוק להפוך תאים בטוח מנותקים מכל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חכו זמן נוסף וחזור במידת הצורך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר כל התאים מנותקים, להוסיף מדיה המכילה סרום לנטרל טריפסין. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העברת התאים צינור צנטריפוגות, ותאי גלולה ידי צנטריפוגה (RCF = 300 XG). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסרת תאים supernatant ו resuspend בנפח ידוע של PBS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ספירת תאים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מעבירים צינור חדש נפח מתאים של השעיה תאים סלולריים כדי לספק את המספר הדרוש של תאים לניסויים (תצטרך 150 μL של תאים לכל גם בצפיפות של 1 x 10 6 תאים / מ&quot;ל). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה תאים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסרת תאים supernatant ו resuspend בהיקף המתאים חיץ Pulser electroporation ג&#39;ין להשיג צפיפות התאים של 1 x 10 6 תאים / מ&quot;ל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 20 מ&quot;ל של מיקרוגרם לכל פלסמיד ההשעיה תא ומערבבים בעדינות. </li></ol> 2) כלי electroporation ההתקנה electroporation פלייט ההתקנה electroporation <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הצלחת הכנס לתוך תא מודול את הכוח של מערכת Pulser electroporation MXcell ג&#39;ין. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פיפטה 150 תא תערובת μL או חיץ לתוך בארות צלחת electroporation 96-היטב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שים צלחת בתא הצלחת הדופק. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את צלחת מ קאמרית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מערבבים היטב על ידי תוכן pipetting למעלה ולמטה גם כל אחד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העברת התאים מבאר כל למאגר מראש התחמם ב 12 גם הצלחות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הקש צלחת להפיץ תאים ושמתי אותו בחממה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בואו תאים להתאושש במשך 24 שעות. </li></ol> קובט ההתקנה electroporation <ol start="9" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> נתק קאמרית צלחת ממודול את כוחה של מערכת Pulser MXcell electroporation ג&#39;ין וחבר ב ShockPod ™ קובט קאמרית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פיפטה 600 μL ההשעיה התא לתוך הפער קובט 0.4 ס&quot;מ electroporation. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שים קובט בתא ShockPod ולספק הדופק חשמלי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר קובט מבית הבליעה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מערבבים את תוכן קובט ידי pipetting למעלה ולמטה קובט. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העברת התאים מבאר כל למאגר מראש התחמם ב 12 גם הצלחות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הקש צלחת להפיץ תאים ושמתי אותו בחממה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בואו התאים להתאושש במשך 24 שעות. </li></ol> 3) נציג תוצאות לאחר transfecting התאים ומאפשר להם להחלים, לנתח את יעילות transfection איכותית, באמצעות מיקרוסקופ epifluorescent ו כמותית, באמצעות cytometry הזרימה. <img src="/files/ftp_upload/1662/1662fig1.jpg" alt="איור 1" /> באיור 1. תאים שעברו electroporated בהצלחה וכעת הם המבטאים את הגן GFP מופיעים תחת מיקרוסקופ epifluorescent. <img src="/files/ftp_upload/1662/1662fig2.jpg" alt="איור 2" /> איור 2. צופה התאים תחת לעומת השלב מאפשרת ויזואליזציה של תאים הן transfected ו untransfected. אלה הם תאים שנחשפו את הדופק הנמוך ביותר electroporation המתח 200V. התאים ומחוברות בעיקר בשל צפיפות התאים גבוהה. <img src="/files/ftp_upload/1662/1662fig3.jpg" alt="איור 3" /> איור 3. אותו שדה הראייה תחת epifluorescence מראה מספר התאים מביעים את סמן ה-GFP, אבל אלה הם רק אחוז קטן של תאים גלויים בתמונה הקודמת. <img src="/files/ftp_upload/1662/1662fig4.jpg" alt="איור 4" /> איור 4. בשלב 250V, המספר הכולל של תאים חיים ראה תחת בניגוד שלב ירידות קלות. <img src="/files/ftp_upload/1662/1662fig5.jpg" alt="איור 5" /> איור 5. תחת epifluorescence, אפשר לראות כי מספר התאים GFP להביע גדל. <img src="/files/ftp_upload/1662/1662fig6.jpg" alt="איור 6" /> איור 6. במתח הגבוה ביותר מיושם, 375V, ישנם תאים חיים פחות גלוי. <img src="/files/ftp_upload/1662/1662fig7.jpg" alt="איור 7" /> איור 7. עם זאת, אחוז גדול של התאים הנותרים מביעים GFP. באיזה מצב הוא אופטימלי תלוי בתכנון הניסוי. בניסויים מסוימים את המספר הגדול ביותר של תאים transfected יכול להיות אופטימלי, בניסויים אחרים transfection האחוז הגבוה ביותר עשוי להיות הטוב ביותר. אנו מעוניינים באחוז התאים GFP חיובית בתנאי אחד ואיך באחוזים משתנים עם הגיל התאים. Cytometry זרימת יכולים לספק מידע כמותי על תוצאות transfection תחת כל התנאים electroporation שונים. <img src="/files/ftp_upload/1662/1662fig8.jpg" alt="איור 8" /> איור 8. כאן את אחוז התאים ה-GFP חיובי במעבר 5 תאים תחת כל אחד מ -12 מצבים electroporation מוצגים. אחוז transfection המרבי היה כ -80% מתחת הדופק הגבוה מתח מעריכי ריקבון, מצב 6, ו -70% תחת הדופק החזק גל מרובע נבדק, מצבו 12. <img src="/files/ftp_upload/1662/1662fig9.jpg" alt="איור 9" /> איור 9. תאים עם עבר 9 פעמים לפני electroporation, את הדפוס הכללי של אחוז transfection כמעט זהה, אך עם ירידה קלה מאוד את אחוזי transfection. <img src="/files/ftp_upload/1662/1662fig10.jpg" alt="איור 10" /> איור 10. המוצג כאן הם אחוז התאים ה-GFP בקטע 13 תאים אשר מראים ירידה ניכרת באחוז transfection יחסית התאים צעירים יותר. האחוזים הגבוהים ביותר היו transfection כמחצית מה הושג עם תאים צעירים להפגין את החשיבות של שימוש בתאים בריאים מיד לאחר הבידוד ככל האפשר. <table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td colspan="3"> Electroporation תנאי שימוש בתאי MEF transfecting באמצעות Pulser ג&#39;ין MXcell </td></tr><tr><td> מצב (06/01) Decay פולסים מעריכי, כל עם 350 UF, 1000ohm </td><td> מתח (V) </td><td></td></tr><tr><td> 1 </td><td> 200 </td><td></td></tr><tr><td> 2 </td><td> 250 </td><td></td></tr><tr><td> 3 </td><td> 300 </td><td></td></tr><tr><td> 4 </td><td> 326 </td><td></td></tr><tr><td> 5 </td><td> 350 </td><td></td></tr><tr><td> 6 </td><td> 376 </td><td></td></tr><tr><td> מצב (12/07) כיכר פולסים Wave, כל עם UF 2000, 1000 אוהם, ו 1 הדופק </td><td> מתח (V) </td><td> Pulse Duration (ms) </td></tr><tr><td> 7 </td><td> 200 </td><td> 10 </td></tr><tr><td> 8 </td><td> 250 </td><td> 10 </td></tr><tr><td> 9 </td><td> 300 </td><td> 10 </td></tr><tr><td> 10 </td><td> 200 </td><td> 20 </td></tr><tr><td> 11 </td><td> 250 </td><td> 20 </td></tr><tr><td> 12 </td><td> 300 </td><td> 20 </td></tr></tbody></table>

המחברים הם מועסקים על ידי Bio-Rad Laboratories המייצרת ריאגנטים מכשיר שימוש במאמר זה

מאמר זה וידאו מדגים כיצד להשתמש במערכת electroporation MXcell לזהות בקלות electroporation תנאים אופטימליים MEFs או אחר שורות תאים ראשוניים. הפורמט 96-היטב צלחת מאפשר רבים משכפל של תנאי הניסוי או אופטימיזציה להתבצע בו זמנית, אשר יכול לבטל את הצורך בניסויים נפרדים רבים. בעת ביצוע הליך זה, יש לזכור להשתמש בתאים בריאים בהקדם לאחר הבידוד ככל האפשר להשתמש התנאים electroporation כי הם מתאימים למאגר electroporation.

<!DOCTYPE html PUBLIC "-//W3C//DTD XHTML 1.0 Transitional//EN" "http://www.w3.org/TR/xhtml1/DTD/xhtml1-transitional.dtd">
<html xmlns="http://www.w3.org/1999/xhtml" xml:lang="en" lang="en">	
		
		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>Gene Pulser&reg; Electroporation Buffer</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Bio-Rad Laboratories, Inc.</td>
<td>165-2676</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Gene Pulser MXcell&trade; Electroporation System</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Bio-Rad Laboratories, Inc.</td>
<td>165-2670</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Gene Pulser MXcell&trade; ShockPod&trade; Cuvette Chamber</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Bio-Rad Laboratories, Inc.</td>
<td>165-2673</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Gene Pulser MXcell&trade; Electroporation System With ShockPod&trade; Cuvette Chamber</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Bio-Rad Laboratories, Inc.</td>
<td>165-2674</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

using the gene pulser mxcell electroporation system to transfect primary cells with high efficiency

זה הופך ברור יותר ויותר כי electroporation היא הדרך היעילה ביותר להציג את ה-DNA או פלסמיד siRNA לתוך תאים ראשוניים. Pulser הגן מערכת MXcell electroporation וג&#39;ין Pulser electroporation חיץ (Bio-Rad) פותחו במיוחד בקלות transfect חומצות גרעין לתאי יונקים קשות transfect תאים, כגון תאים ראשוניים גזע. אנו מדגימים כיצד לבצע ניסוי פשוט לזהות במהירות את התנאים electroporation הטוב ביותר. נדגים איך לנהל מספר דוגמאות באמצעות מגוון של תנאים electroporation כך ניסוי ניתן לבצע באותו זמן כמו אופטימיזציה מבוצעת. אנו גם להראות כיצד תנאים אופטימליים מזוהה באמצעות 96-היטב צלחות electroporation ניתן להשתמש cuvettes electroporation סטנדרטי, הקלת לעבור צלחות electroporation כדי cuvettes electroporation תוך שמירה על יעילות electroporation אותו. בסרטון, אנו ידונו גם כמה גורמי מפתח שיכולים להוביל להצלחה או כישלון של ניסויים electroporation.

Watch this Scientific Journal Video about Using the Gene Pulser MXcell Electroporation System to Transfect Primary Cells with High Efficiency at JoVE.com

Using the Gene Pulser MXcell Electroporation System to Transfect Primary Cells with High Efficiency (Video) | JoVE

הליך זה מראה כיצד להשתמש ג&#39;ין Pulser מערכת MXcell electroporation במהירות ובקלות לזהות את התנאים הטובים ביותר עבור electroporation fibroblasts העכבר עובריים (MEFs) או תאים ראשוניים אחרים. שיקולים לפתרון בעיות הם דנו גם וידאו המשויכת.

שימוש ג&#39;ין Pulser מערכת MXcell electroporation כדי Transfect תאים ראשוניים עם יעילות גבוהה

It is becoming increasingly apparent that electroporation is the most effective way to introduce plasmid DNA or siRNA into primary cells. The Gene Pulser ...

Research

JoVE Journal

Biology

Using the Gene Pulser MXcell Electroporation System to Transfect Primary Cells with High Efficiency

Electroporation of Mycobacteria

Electroporation of Mycobacteria (Video) | JoVE

Electroporation של mycobacteria

High efficiency transformation is a major limitation in the study of mycobacteria. The genus Mycobacterium can be difficult to transform; this is mainly ...

The Preparation of Primary Hematopoietic Cell Cultures From Murine Bone Marrow for Electroporation

The Preparation of Primary Hematopoietic Cell Cultures From Murine Bone Marrow for Electroporation (Video) | JoVE

הכנת ראשי בתרביות תאים hematopoietic ממח העצם Murine עבור electroporation

In utero and ex vivo Electroporation for Gene Expression in Mouse Retinal Ganglion Cells

In utero and ex vivo Electroporation for Gene Expression in Mouse Retinal Ganglion Cells (Video) | JoVE

ב electroporation ברחם לשעבר vivo על ביטוי גנים בתאים עכבר גנגליון רשתית

The retina and its sole output neuron, the retinal ganglion cell (RGC), comprise an excellent model in which to examine biological questions such as cell ...

Primary Culture and Plasmid Electroporation of the Murine Organ of Corti. 

Primary Culture and Plasmid Electroporation of the Murine Organ of Corti. (Video) | JoVE

תרבות ראשיים electroporation פלסמיד של האיבר Murine של קורטי.

In all mammals, the sensory epithelium for audition is located along the spiraling organ of Corti that resides within the conch shaped cochlea of the ...

Using an Automated Cell Counter to Simplify Gene Expression Studies: siRNA Knockdown of IL-4 Dependent Gene Expression in Namalwa Cells

Using an Automated Cell Counter to Simplify Gene Expression Studies: siRNA Knockdown of IL-4 Dependent Gene Expression in Namalwa Cells (Video) | JoVE

שימוש מונה תא אוטומטי כדי לפשט את הביטוי מחקרים ג&#39;ין: siRNA מציאה הביטוי IL 4-Gene תלויים תאים Namalwa

The use of siRNA mediated gene knockdown is continuing to be an important tool in studies of gene expression.  siRNA studies are being conducted not only ...

Quantification of dsDNA using the Hitachi F-7000 Fluorescence Spectrophotometer and PicoGreen Dye

Quantification of dsDNA using the Hitachi F-7000 Fluorescence Spectrophotometer and PicoGreen Dye (Video) | JoVE

כימות dsDNA באמצעות ה-F-7000 Hitachi Fluorescence ספקטרופוטומטר ו PicoGreen דיי

Quantification of DNA, especially in small concentrations, is an important task with a wide range of biological applications including standard molecular ...

siRNA Screening to Identify Ubiquitin and Ubiquitin-like System Regulators of Biological Pathways in Cultured Mammalian Cells

siRNA Screening to Identify Ubiquitin and Ubiquitin-like System Regulators of Biological Pathways in Cultured Mammalian Cells (Video) | JoVE

הקרנת siRNA לזיהוי יוביקוויטין ורגולטורים מערכת דמויות יוביקוויטין של מסלולים ביולוגיים בתאי יונקים בתרבית

Post-translational modification of proteins with ubiquitin and ubiquitin-like molecules (UBLs) is emerging as a dynamic cellular signaling network that ...

Reverse Genetic Morpholino Approach Using Cardiac Ventricular Injection to Transfect Multiple Difficult-to-target Tissues in the Zebrafish Larva

Reverse Genetic Morpholino Approach Using Cardiac Ventricular Injection to Transfect Multiple Difficult-to-target Tissues in the Zebrafish Larva (Video) | JoVE

הפוך גישת morpholino גנטית באמצעות הזרקת לב חדרית לtransfect רקמות קשה ליעד מרובים בזחל דג הזברה

The zebrafish is an important model to understand the cell and molecular biology of organ and appendage regeneration. However, molecular strategies to ...

High Efficiency Differentiation of Human Pluripotent Stem Cells to Cardiomyocytes and Characterization by Flow Cytometry

High Efficiency Differentiation of Human Pluripotent Stem Cells to Cardiomyocytes and Characterization by Flow Cytometry (Video) | JoVE

בידול יעילות גבוה של תאי גזע pluripotent האדם לשריר לב ואפיון על ידי cytometry הזרימה

There is an urgent need to develop approaches for repairing the damaged heart, discovering new therapeutic drugs that do not have toxic effects on the ...

High Content Screening Analysis to Evaluate the Toxicological Effects of Harmful and Potentially Harmful Constituents (HPHC)

High Content Screening Analysis to Evaluate the Toxicological Effects of Harmful and Potentially Harmful Constituents HPHC (Video) | JoVE

ניתוח הקרנת תכולה גבוהה כדי להעריך את ההשפעות טוקסיקולוגי של מזיקים מזיקים מרכיבים (HPHC)

Cigarette smoke (CS) is a major risk factor for cardiovascular and lung diseases. Because CS is a complex aerosol containing more than 7,000 chemicals1 it ...