Name: measuring plasma membrane protein endocytic rates by reversible biotinylation
Uploaded: 2009-12-23T16:00:00
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Diese Arbeit wurde vom NIH geförderten # DA15169 zu HEM

Vorgehensweise im Überblick: Mit diesem Ansatz sind Zelloberfläche Proteine ​​kovalent mit Biotin auf den verfügbaren extrazellulären Lysin-Reste mit einer Membran impermeante, Disulfid-gekoppelten Biotinylierungsreagenz (Sulfo-NHS-SS-Biotin) unter Menschenhandel restriktiven Bedingungen (zB bei niedriger Temperatur) bezeichnet (siehe Abb.. 1 zur Illustration). Eine Gruppe von Zellen zur Bekämpfung permissiven Bedingungen verschoben (37 ° C) und biotinylierte Proteine ​​zu verinn...

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	<li>Holton, K. L., Loder, M. K., Melikian, H. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nonclassical+distinct+endocytic+signals+dictate+constitutive+and+PKC-regulated+neurotransmitter+transporter+internalization.">Nonclassical distinct endocytic signals dictate constitutive and PKC-regulated neurotransmitter transporter internalization.</a> Nat Neurosci. 8, 881-888 (2005).</li><li>Boudanova, E., Navaroli, D. M., Melikian, H. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Amphetamine-induced+decreases+in+dopamine+transporter+surface+expression+are+protein+kinase+C-independent.">Amphetamine-induced decreases in dopamine transporter surface expression are protein kinase C-independent.</a> Neuropharmacology. 54, 605-612 (2008).</li><li>Boudanova, E., Navaroli, D. M., Stevens, Z., Melikian, H. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dopamine+transporter+endocytic+determinants:+carboxy+terminal+residues+critical+for+basal+and+PKC-stimulated+internalization.">Dopamine transporter endocytic determinants: carboxy terminal residues critical for basal and PKC-stimulated internalization.</a> Mol Cell Neurosci. 39, 211-217 (2008).</li><li>Loder, M. K., Melikian, H. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+dopamine+transporter+constitutively+internalizes+and+recycles+in+a+protein+kinase+C-regulated+manner+in+stably+transfected+PC12+cell+lines.">The dopamine transporter constitutively internalizes and recycles in a protein kinase C-regulated manner in stably transfected PC12 cell lines.</a> J Biol Chem. 278, 22168-22174 (2003).</li></ol>

Häufige Probleme: Das häufigste Problem, dass bei diesen Versuchen ergibt sich ist schlecht Streifen Effizienz. Die Effizienz des Streifens ist von entscheidender Bedeutung in der Lage, die Ergebnisse zu interpretieren. Sofern der Streifen wurde hocheffiziente, ist es nicht möglich festzustellen, dass jeder biotinylierten Proteinen in die Internalisierung Gassen, waren in der Tat, verinnerlicht von der Oberfläche. Strips ≥ 90% Wirkungsgrad sind optimal, und wir verwerfen Ergebnisse, wenn die Streifen unter ...

measuring plasma membrane protein endocytic rates by reversible biotinylation

Plasma-Membran-Proteine ​​sind eine große, heterogene Gruppe von Proteinen, Rezeptoren, Ionenkanäle, Transporter und Pumpen umfasst. Die Aktivität dieser Proteine ​​ist verantwortlich für eine Vielzahl von Schlüsselbegriffen zellulären Ereignissen, einschließlich Nährstoffzufuhr, zelluläre Erregbarkeit und chemische Signalisierung. Viele Plasmamembranproteinen werden dynamisch von endocytischen Menschenhandel, die Funktion von Proteinen moduliert durch die Veränderung Proteinoberfläche Ausdruck geregelt. Die Mechanismen, die Protein Endocytose zu erleichtern, sind komplex und nicht vollständig für viele Membranproteine ​​verstanden. Um das Verständnis der Mechanismen, die die endocytischen Handel mit einem bestimmten Protein-Steuerung, ist es entscheidend, dass das Protein s endocytischen Rate präzise gemessen werden. Für viele Rezeptoren, sind direkte endocytischen Rate-Messungen häufig erreicht Verwendung markierter Rezeptor-Liganden. Doch für viele Klassen von Membranproteinen, wie etwa Transporter, Pumpen und Ionenkanäle, gibt es keine passende Ligand, mit dem die endocytischen Rate gemessen werden kann. In dem vorliegenden Bericht beschreiben wir eine reversible Biotinylierung Methode, die wir einsetzen, um die Dopamin-Transporter (DAT) endocytischen zu messen. Diese Methode stellt eine einfache Methode zur Messung von Internalisierung Raten und kann leicht für den Handel mit Studien der meisten Membranproteine ​​eingesetzt werden.

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Measuring Plasma Membrane Protein Endocytic Rates by Reversible Biotinylation

Regulierte Endozytose regelt die Zelloberflächenexpression Ebenen der Mehrheit der Membranproteinen. Hier nutzen wir reduzierbar, Membran impermeante Biotinylierungsreagenzien die endocytischen Rate der Dopamin-Transporter (DAT), ein polytoper Membranprotein zu messen. Das Verfahren ermöglicht eine einfache Methode zur Messung der Endozytose von den meisten Plasmamembranproteinen.

Mess-Plasmamembranprotein endocytischen Preise von Reversible Biotinylierung

Plasma membrane proteins are a large, diverse group of proteins comprised of receptors, ion channels, transporters and pumps.  Activity of these proteins ...

Research

JoVE Journal

Biology

Measuring Near Plasma Membrane and Global Intracellular Calcium Dynamics in Astrocytes

Messen in der Nähe Plasmamembran und Global intrazellulären Calcium-Dynamics in Astrozyten

The brain contains glial cells.  Astrocytes, a type of glial cell, have long been known to provide a passive supportive role to neurons. However, ...

Forschung

Biologie

Measuring the Induced Membrane Voltage with Di-8-ANEPPS

Messung der induzierten Spannung Membran mit Di-8-ANEPPS

Placement of a cell into an external electric field causes a local charge redistribution inside and outside of the cell in the vicinity of the cell ...

Quantitative Measurement of GLUT4 Translocation to the Plasma Membrane by Flow Cytometry

Quantitative Messung der GLUT4 Translokation an die Plasmamembran mittels Durchflusszytometrie

Glucose is the main source of energy for the body, requiring constant regulation of its blood concentration. Insulin release by the pancreas induces ...

Mapping Molecular Diffusion in the Plasma Membrane by Multiple-Target Tracing (MTT)

Mapping Molecular Diffusion in the Plasma Membrane by Multiple-Target Tracing MTT

Mapping molekulare Diffusion in der Plasmamembran durch Multiple-Target Tracing (MTT)

Our goal is to obtain a comprehensive description of molecular processes occurring at cellular membranes in different biological functions. We aim at ...

Harvesting and Cryo-cooling Crystals of Membrane Proteins Grown in Lipidic Mesophases for Structure Determination by Macromolecular Crystallography

Ernte-und Cryo-Kühlung Kristalle von Membranproteinen in Lipidische Mesophasen zur Strukturaufklärung von Makromolekulare Kristallographie Grown

An important route to understanding how proteins function at a mechanistic level is to have the structure of the target protein available, ideally at ...

Real-time Analyses of Retinol Transport by the Membrane Receptor of Plasma Retinol Binding Protein

Real-time Analyse von Retinol Transport durch die Membran-Rezeptor von Plasma Retinol Binding Protein

Vitamin A is essential for vision and the growth/differentiation of almost all human organs.  Plasma retinol binding protein (RBP) is the principle and ...

Imaging Plasma Membrane Deformations With pTIRFM

Imaging Plasmamembran Verformungen Mit pTIRFM

To gain novel insights into the dynamics of exocytosis, our group focuses on the changes in lipid bilayer shape that must be precisely regulated during ...

Green Fluorescent Protein-based Expression Screening of Membrane Proteins in Escherichia coli

Green Fluorescent Protein-based Expression Screening of Membrane Proteins in Escherichia coli

Green Fluorescent Protein-basierte Screening Expression von Membranproteinen in<em&gt; Escherichia coli</em

The production of recombinant membrane proteins for structural and functional studies remains technically challenging due to low levels of expression and ...

Membrane Transport Processes Analyzed by a Highly Parallel Nanopore Chip System at Single Protein Resolution

Membrantransportprozesse durch eine hochparallele Nanopore Chip-System bei Einzel Protein Resolution Analysierte

Membrane protein transport on the single protein level still evades detailed analysis, if the substrate translocated is non-electrogenic. Considerable ...

Determination of Plasma Membrane Partitioning for Peripherally-associated Proteins

Bestimmung der Plasmamembran Partitionierung für peripher-assoziierte Proteine

This method provides a fast approach for the determination of plasma membrane partitioning of any fluorescently-tagged peripherally-associated protein ...