Name: measuring plasma membrane protein endocytic rates by reversible biotinylation
Uploaded: 2009-12-23T16:00:00
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この作品は、＃DA15169 HEMにNIHの助成金によって賄われていた

手順の概要： このアプローチを使用して、細胞表面のタンパク質が共有結合膜の透過性を使用して、使用可能な外リジン残基上のビオチンで標識され、人身売買制限された条件下でのジスルフィド結合のビオチン化試薬（スルホ- NHS - SS -ビオチン）（すなわち、低温）（図1参照説明のため）。細胞の1つのセットが人身売買許容条件にシフトし（37℃）とビオチン化タンパ...

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	<li>Holton, K. L., Loder, M. K., Melikian, H. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nonclassical+distinct+endocytic+signals+dictate+constitutive+and+PKC-regulated+neurotransmitter+transporter+internalization.">Nonclassical distinct endocytic signals dictate constitutive and PKC-regulated neurotransmitter transporter internalization.</a> Nat Neurosci. 8, 881-888 (2005).</li><li>Boudanova, E., Navaroli, D. M., Melikian, H. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Amphetamine-induced+decreases+in+dopamine+transporter+surface+expression+are+protein+kinase+C-independent.">Amphetamine-induced decreases in dopamine transporter surface expression are protein kinase C-independent.</a> Neuropharmacology. 54, 605-612 (2008).</li><li>Boudanova, E., Navaroli, D. M., Stevens, Z., Melikian, H. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dopamine+transporter+endocytic+determinants:+carboxy+terminal+residues+critical+for+basal+and+PKC-stimulated+internalization.">Dopamine transporter endocytic determinants: carboxy terminal residues critical for basal and PKC-stimulated internalization.</a> Mol Cell Neurosci. 39, 211-217 (2008).</li><li>Loder, M. K., Melikian, H. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+dopamine+transporter+constitutively+internalizes+and+recycles+in+a+protein+kinase+C-regulated+manner+in+stably+transfected+PC12+cell+lines.">The dopamine transporter constitutively internalizes and recycles in a protein kinase C-regulated manner in stably transfected PC12 cell lines.</a> J Biol Chem. 278, 22168-22174 (2003).</li></ol>

一般的な問題 ：これらの実験で発生する最も一般的な問題は、貧しいストリップ効率です。ストリップの効率は、結果を解釈できることに非常に重要です。ストリップは非常に効率的でない限り、それは内面化の車線内の任意のビオチン化タンパク質は、実際には、表面から内部化されたと結論することはできません。ストリップ≥90％の効率が最適であり、そしてストリップがこの?...

measuring plasma membrane protein endocytic rates by reversible biotinylation

細胞膜タンパク質は、受容体、イオンチャネル、トランスポーターとポンプで構成されるタンパク質の大規模、多様なグループです。これらのタンパク質の活性は栄養デリバリー、細胞の興奮、および化学的シグナル伝達を含む主要な携帯電話のイベント、様々な責任があります。多くの細胞膜タンパク質は、動的にタンパク質の表面発現を変化させることによってタンパク質の機能を調節するエンドサイトーシスの人身売買、によって規制されている。タンパク質のエンドサイトーシスを促進するメカニズムは複雑であり、完全に多くの膜蛋白質のために理解されていません。完全に与えられたタンパク質のエンドサイトーシス売買を制御するメカニズムを理解するためには、それはタンパク質のエンドサイトーシスの速度を正確に測定することが重要です。多くの受容体の場合は、直接エンドサイトーシスの速度の測定は、頻繁に標識された受容体リガンドを利用して実現されています。しかし、そのようなトランスポーター、ポンプ、イオンチャネルなど膜タンパク質の多くのクラスに対して、エンドサイトーシス速度を測定するために使用できる便利なリガンドはありません。本報告では、我々はドーパミントランスポーター（DAT）エンドサイトーシス率を測定するために採用することを可逆的ビオチン化の方法を説明します。このメソッドは、内在化率を測定するための直接的なアプローチを提供し、容易にほとんどの膜タンパク質の人身売買の研究に用いることができる。

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Measuring Plasma Membrane Protein Endocytic Rates by Reversible Biotinylation

規制エンドサイトーシスは、膜タンパク質の大部分の細胞表面発現レベルを制御します。ここでは、ドーパミントランスポーター（DAT）、ポリトープ膜​​タンパク質のエンドサイトーシス率を測定するために還元、膜非透過性ビオチン化試薬を利用する。メソッドは、ほとんどの細胞膜タンパク質のエンドサイトーシス率を測定するための直接的なアプローチを促進する。

リバーシブルビオチン化によって原形質膜タンパク質エンドサイトーシス率を測定

Plasma membrane proteins are a large, diverse group of proteins comprised of receptors, ion channels, transporters and pumps.  Activity of these proteins ...

Research

JoVE Journal

Biology

Measuring Near Plasma Membrane and Global Intracellular Calcium Dynamics in Astrocytes

アストロサイトの細胞膜とグローバル細胞内カルシウム動態の近くの測定

The brain contains glial cells.  Astrocytes, a type of glial cell, have long been known to provide a passive supportive role to neurons. However, ...

Measuring the Induced Membrane Voltage with Di-8-ANEPPS

ジ- 8 - ANEPPSで誘起膜電位の測定

Placement of a cell into an external electric field causes a local charge redistribution inside and outside of the cell in the vicinity of the cell ...

Quantitative Measurement of GLUT4 Translocation to the Plasma Membrane by Flow Cytometry

フローサイトメトリーによる細胞膜へのGLUT4転の定量的測定

Glucose is the main source of energy for the body, requiring constant regulation of its blood concentration. Insulin release by the pancreas induces ...

Mapping Molecular Diffusion in the Plasma Membrane by Multiple-Target Tracing (MTT)

Mapping Molecular Diffusion in the Plasma Membrane by Multiple-Target Tracing MTT

複数のターゲットトレース（MTT）による原形質膜中の分子拡散のマッピング

Our goal is to obtain a comprehensive description of molecular processes occurring at cellular membranes in different biological functions. We aim at ...

Harvesting and Cryo-cooling Crystals of Membrane Proteins Grown in Lipidic Mesophases for Structure Determination by Macromolecular Crystallography

高分子結晶学による構造決定のための脂質メソフェーズで栽培膜タンパク質の収穫とクライオ冷却結晶

An important route to understanding how proteins function at a mechanistic level is to have the structure of the target protein available, ideally at ...

Real-time Analyses of Retinol Transport by the Membrane Receptor of Plasma Retinol Binding Protein

血漿レチノール結合タンパク質の膜受容体によってレチノール交通のリアルタイム解析

Vitamin A is essential for vision and the growth/differentiation of almost all human organs.  Plasma retinol binding protein (RBP) is the principle and ...

Imaging Plasma Membrane Deformations With pTIRFM

pTIRFMによる画像形成細胞膜変形は

To gain novel insights into the dynamics of exocytosis, our group focuses on the changes in lipid bilayer shape that must be precisely regulated during ...

Green Fluorescent Protein-based Expression Screening of Membrane Proteins in Escherichia coli

Green Fluorescent Protein-based Expression Screening of Membrane Proteins in Escherichia coli

膜タンパク質の緑色蛍光タンパク質ベースの発現スクリーニングで<em&gt;エシェリヒア·コリ</em

The production of recombinant membrane proteins for structural and functional studies remains technically challenging due to low levels of expression and ...

Membrane Transport Processes Analyzed by a Highly Parallel Nanopore Chip System at Single Protein Resolution

単一のタンパク質解像度で高並列ナノ細孔チップシステムにより分析膜輸送プロセス

Membrane protein transport on the single protein level still evades detailed analysis, if the substrate translocated is non-electrogenic. Considerable ...

Determination of Plasma Membrane Partitioning for Peripherally-associated Proteins

細胞膜の末梢関連タンパク質の分割の決定

This method provides a fast approach for the determination of plasma membrane partitioning of any fluorescently-tagged peripherally-associated protein ...