Name: measuring plasma membrane protein endocytic rates by reversible biotinylation
Uploaded: 2009-12-23T16:00:00
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이 작품은 # DA15169 앙에 NIH 교부금에 의해 투자되었다

절차 개요 : 이 방법을 사용하여, 세포 표면 단백질은 covalently (그림 참조 1. 인신 매매 제한 조건 (즉, 낮은 온도)에서 막 impermeant, 이황화 결합 biotinylation 시약을 (sulfo - NHS - SS - 비오틴)를 사용하여 사용 가능한 세포 리신 잔류물에 비오틴과 레이블 아르 그림에 대한). 세포 중 하나 세트 매매 허용 조건 이동 (37 ° C)와 biotinylated 단백질 internalize입니다. 세포의 다른 집합 시간 = 0 ...

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	<li>Holton, K. L., Loder, M. K., Melikian, H. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nonclassical+distinct+endocytic+signals+dictate+constitutive+and+PKC-regulated+neurotransmitter+transporter+internalization.">Nonclassical distinct endocytic signals dictate constitutive and PKC-regulated neurotransmitter transporter internalization.</a> Nat Neurosci. 8, 881-888 (2005).</li><li>Boudanova, E., Navaroli, D. M., Melikian, H. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Amphetamine-induced+decreases+in+dopamine+transporter+surface+expression+are+protein+kinase+C-independent.">Amphetamine-induced decreases in dopamine transporter surface expression are protein kinase C-independent.</a> Neuropharmacology. 54, 605-612 (2008).</li><li>Boudanova, E., Navaroli, D. M., Stevens, Z., Melikian, H. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dopamine+transporter+endocytic+determinants:+carboxy+terminal+residues+critical+for+basal+and+PKC-stimulated+internalization.">Dopamine transporter endocytic determinants: carboxy terminal residues critical for basal and PKC-stimulated internalization.</a> Mol Cell Neurosci. 39, 211-217 (2008).</li><li>Loder, M. K., Melikian, H. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+dopamine+transporter+constitutively+internalizes+and+recycles+in+a+protein+kinase+C-regulated+manner+in+stably+transfected+PC12+cell+lines.">The dopamine transporter constitutively internalizes and recycles in a protein kinase C-regulated manner in stably transfected PC12 cell lines.</a> J Biol Chem. 278, 22168-22174 (2003).</li></ol>

일반적인 문제 :이 실험에서 발생하는 가장 일반적인 문제는 가난한 스트립의 효율성이다. 스트립의 효율 결과를 해석하는 수있는에 중요합니다. 스트립은 매우 효율적인 게 아니라면, 그것은 국제화 차선에 biotinylated 단백질의 표면에서 internalized 사실에 있다고 결론하는 것은 불가능합니다. 스트립 ≥ 90 % 효율이 최적이며, 스트립이 수준 아래로 떨어지면면 우리는 어떤 결과를 폐기하십시...

measuring plasma membrane protein endocytic rates by reversible biotinylation

플라즈마 막 단백질은 수용체, 이온 채널, 전송기 및 펌프로 구성된 단백질 많은 다양한 그룹입니다. 이 단백질의 활동이 양분 전달, 세포 흥분, 화학 신호를 포함한 주요 세포 행사의 다양한 책임이 있습니다. 대부분의 플라스마 막 단백질은 동적 단백질 표면 표현을 변경하여 단백질 기능을 modulates endocytic 인신 매매에 의해 규제됩니다. 단백질 endocytosis를 촉진 메커니즘은 복잡하며 충분히 많은 막 단백질에 대한 이해되지 않습니다. 완전히 주어진 단백질의 endocytic 밀매를 제어하는​​ 메커니즘을 이해하기 위해서는 단백질의 endocytic 속도가 정확하게 측정하는 것이 중요합니다. 많은 수용체에 대한 직접 endocytic 속도 측정이 자주 표시 수용체 리간드를 활용 달성하고 있습니다. 그러나, 전송기, 펌프와 이온 채널과 같은 막 단백질의 여러 클래스에 대한, endocytic 속도를 측정하는 데 사용할 수있는 편리 리간드가 없습니다. 현재 보고서에서, 우리는 도파민 수송 (DAT) endocytic 속도를 측정하기 위하여 고용 가역 biotinylation 방법을 설명합니다. 이 방법은 국제화 속도를 측정하는 간단한 방법을 제공하며, 쉽게 대부분의 막 단백질의 밀매 연구에 대한 고용 수 있습니다.

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Measuring Plasma Membrane Protein Endocytic Rates by Reversible Biotinylation

규제 endocytosis는 막 단백질의 대부분의 세포 표면 발현 수준을 관리합니다. 여기서 우리는 도파민 전송 (DAT), polytopic 멤브레인 단백질의 endocytic 속도를 측정하는 줄이할 수있는, 멤브레인 impermeant biotinylation의 시약을 사용합니다. 방법은 대부분의 플라즈마 막 단백질의 endocytic 속도를 측정하는 직접적인 접근을 용이하게합니다.

가역 Biotinylation에 의해 플라즈마 막 단백질 Endocytic 요금 측정

Plasma membrane proteins are a large, diverse group of proteins comprised of receptors, ion channels, transporters and pumps.  Activity of these proteins ...

Research

JoVE Journal

Biology

Measuring Near Plasma Membrane and Global Intracellular Calcium Dynamics in Astrocytes

Astrocytes의 플라즈마 막 글로벌 세포내 칼슘 역학 니어 측정

The brain contains glial cells.  Astrocytes, a type of glial cell, have long been known to provide a passive supportive role to neurons. However, ...

연구

생물학

Measuring the Induced Membrane Voltage with Di-8-ANEPPS

디 - 8 - ANEPPS으로 유도된 막 전압 측정

Placement of a cell into an external electric field causes a local charge redistribution inside and outside of the cell in the vicinity of the cell ...

Quantitative Measurement of GLUT4 Translocation to the Plasma Membrane by Flow Cytometry

유동세포계측법에 의해 플라즈마 막에 GLUT4 Translocation의 양적 측정

Glucose is the main source of energy for the body, requiring constant regulation of its blood concentration. Insulin release by the pancreas induces ...

Mapping Molecular Diffusion in the Plasma Membrane by Multiple-Target Tracing (MTT)

Mapping Molecular Diffusion in the Plasma Membrane by Multiple-Target Tracing MTT

다중 타겟 추적 (MTT)에 의해 플라즈마 막의 분자 확산을 매핑

Our goal is to obtain a comprehensive description of molecular processes occurring at cellular membranes in different biological functions. We aim at ...

Harvesting and Cryo-cooling Crystals of Membrane Proteins Grown in Lipidic Mesophases for Structure Determination by Macromolecular Crystallography

Macromolecular의 결정학에 의해 구조 결정에 대한 Lipidic Mesophases에서 재배 막 단백질의 수확 및 Cryo 냉각 크리스털

An important route to understanding how proteins function at a mechanistic level is to have the structure of the target protein available, ideally at ...

Real-time Analyses of Retinol Transport by the Membrane Receptor of Plasma Retinol Binding Protein

플라즈마 레티놀 바인딩 단백질의 막 수용체의 레티놀 전송의 실시간 분석

Vitamin A is essential for vision and the growth/differentiation of almost all human organs.  Plasma retinol binding protein (RBP) is the principle and ...

Imaging Plasma Membrane Deformations With pTIRFM

pTIRFM와 이미징 플라즈마 막 변형

To gain novel insights into the dynamics of exocytosis, our group focuses on the changes in lipid bilayer shape that must be precisely regulated during ...

Green Fluorescent Protein-based Expression Screening of Membrane Proteins in Escherichia coli

Green Fluorescent Protein-based Expression Screening of Membrane Proteins in Escherichia coli

막 단백질의 녹색 형광 단백질 기반의 표현 상영에<em&gt; 대장균</em

The production of recombinant membrane proteins for structural and functional studies remains technically challenging due to low levels of expression and ...

Membrane Transport Processes Analyzed by a Highly Parallel Nanopore Chip System at Single Protein Resolution

멤브레인 운송은 단일 단백질 해상도에서 고도의 병렬 나노 기공 칩 시스템에 의해 분석 처리합니다

Membrane protein transport on the single protein level still evades detailed analysis, if the substrate translocated is non-electrogenic. Considerable ...

Determination of Plasma Membrane Partitioning for Peripherally-associated Proteins

원형질 막 주변 관련 된 단백질에 대 한 분할 결정

This method provides a fast approach for the determination of plasma membrane partitioning of any fluorescently-tagged peripherally-associated protein ...