Name: measuring plasma membrane protein endocytic rates by reversible biotinylation
Uploaded: 2009-12-23T16:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Measuring Plasma Membrane Protein Endocytic Rates by Reversible Biotinylation at JoVE.com

Detta arbete har finansierats av NIH bidrag # DA15169 till HEM

Förfarande Översikt: Med hjälp av denna metod är cellytan proteiner kovalent märkt med biotin om tillgängliga extracellulära lysinrester med ett membran impermeant, disulfide-kopplad biotinylation reagens (sulfo-NHS-SS-biotin) under handel begränsande villkor (dvs låg temperatur) (se Figur 1. för illustration). En uppsättning av celler flyttas över till människohandel begränsande villkor (37 ° C) och biotinylerad proteiner internalisera. Den andra uppsättningen celler hålls vi...

<ol>
	<li>Holton, K. L., Loder, M. K., Melikian, H. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nonclassical+distinct+endocytic+signals+dictate+constitutive+and+PKC-regulated+neurotransmitter+transporter+internalization.">Nonclassical distinct endocytic signals dictate constitutive and PKC-regulated neurotransmitter transporter internalization.</a> Nat Neurosci. 8, 881-888 (2005).</li><li>Boudanova, E., Navaroli, D. M., Melikian, H. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Amphetamine-induced+decreases+in+dopamine+transporter+surface+expression+are+protein+kinase+C-independent.">Amphetamine-induced decreases in dopamine transporter surface expression are protein kinase C-independent.</a> Neuropharmacology. 54, 605-612 (2008).</li><li>Boudanova, E., Navaroli, D. M., Stevens, Z., Melikian, H. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dopamine+transporter+endocytic+determinants:+carboxy+terminal+residues+critical+for+basal+and+PKC-stimulated+internalization.">Dopamine transporter endocytic determinants: carboxy terminal residues critical for basal and PKC-stimulated internalization.</a> Mol Cell Neurosci. 39, 211-217 (2008).</li><li>Loder, M. K., Melikian, H. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+dopamine+transporter+constitutively+internalizes+and+recycles+in+a+protein+kinase+C-regulated+manner+in+stably+transfected+PC12+cell+lines.">The dopamine transporter constitutively internalizes and recycles in a protein kinase C-regulated manner in stably transfected PC12 cell lines.</a> J Biol Chem. 278, 22168-22174 (2003).</li></ol>

Vanliga problem: Det vanligaste problemet som uppstår i dessa experiment är dålig band effektivitet. Effektiviteten av remsan är avgörande i att kunna tolka resultaten. Om inte remsan var mycket effektiv, är det inte möjligt att dra slutsatsen att någon biotinylerad proteiner i internaliseringen körfält var i själva verket internaliserade från ytan. Strips ≥ 90% effektivitet är optimala och vi kasta några resultat om remsan sjunker under denna nivå. Ett exempel på ett dåligt band visas i figur ...

measuring plasma membrane protein endocytic rates by reversible biotinylation

Plasma membranproteiner är ett stort och mångskiftande grupp av proteiner som består av receptorer, jonkanaler, transportörer och pumpar. Aktiviteten hos dessa proteiner är ansvarig för en rad viktiga cellulära händelser, bland annat näringstillförsel, cellulär retbarhet och kemiska signalering. Många plasma membranproteiner är dynamiskt regleras av endocytic människohandel, som modulerar proteiners funktion genom att förändra uttrycket protein yta. De mekanismer som underlättar protein endocytos är komplexa och inte helt klarlagda för många membranproteiner. För att till fullo förstå de mekanismer som styr endocytic handel med ett visst protein är det viktigt att proteinet är endocytic hastighet exakt mätas. För många receptorer, är direkta endocytic takt mätningar ofta uppnås utnyttja märkt receptor ligander. Men för många klasser av membranproteiner, exempelvis transportörer, pumpar och jonkanaler, det finns ingen praktisk ligand som kan användas för att mäta endocytic takt. I denna rapport beskriver vi en reversibel biotinylation metod som vi använder för att mäta dopamin transportören (DAT) endocytic kurs. Denna metod ger en enkel metod för att mäta internalisering priser, och kan lätt användas för handel studier av de flesta membranproteiner.

Watch this Scientific Journal Video about Measuring Plasma Membrane Protein Endocytic Rates by Reversible Biotinylation at JoVE.com

Measuring Plasma Membrane Protein Endocytic Rates by Reversible Biotinylation

Reglerad endocytos styr cellens nivåerna ytan uttryck för majoriteten av membranproteiner. Här använder vi reducera, membran impermeant biotinylation reagenser för att mäta endocytic hastighet av dopamin transportören (DAT), en polytopic membranprotein. Metoden möjliggör en okomplicerad metod för att mäta endocytic andelen flesta plasma membranproteiner.

Mätning Plasma membranprotein Endocytic priser genom reversibel Biotinylation

Plasma membrane proteins are a large, diverse group of proteins comprised of receptors, ion channels, transporters and pumps.  Activity of these proteins ...

Research

JoVE Journal

Biology

Measuring Near Plasma Membrane and Global Intracellular Calcium Dynamics in Astrocytes

Mätning nära plasmamembran och Global Intracellulär Dynamics Kalcium i Astrocyter

The brain contains glial cells.  Astrocytes, a type of glial cell, have long been known to provide a passive supportive role to neurons. However, ...

Measuring the Induced Membrane Voltage with Di-8-ANEPPS

Mätning av Induced Membran spänningen med Di-8-ANEPPS

Placement of a cell into an external electric field causes a local charge redistribution inside and outside of the cell in the vicinity of the cell ...

Quantitative Measurement of GLUT4 Translocation to the Plasma Membrane by Flow Cytometry

Kvantitativ mätning av GLUT4 Translokation till plasmamembranet med flödescytometri

Glucose is the main source of energy for the body, requiring constant regulation of its blood concentration. Insulin release by the pancreas induces ...

Mapping Molecular Diffusion in the Plasma Membrane by Multiple-Target Tracing (MTT)

Mapping Molecular Diffusion in the Plasma Membrane by Multiple-Target Tracing MTT

Kartläggning molekylär diffusion i plasmamembranet med Multiple-Target Tracing (MTT)

Our goal is to obtain a comprehensive description of molecular processes occurring at cellular membranes in different biological functions. We aim at ...

Harvesting and Cryo-cooling Crystals of Membrane Proteins Grown in Lipidic Mesophases for Structure Determination by Macromolecular Crystallography

Avverkning och Cryo-kylning Kristaller av membranproteiner som odlas i lipida mesofaser för strukturbestämning genom Makromolekylär kristallografi

An important route to understanding how proteins function at a mechanistic level is to have the structure of the target protein available, ideally at ...

Real-time Analyses of Retinol Transport by the Membrane Receptor of Plasma Retinol Binding Protein

Realtid Analyser av Retinol Transport från membranreceptor av plasma Retinol Binding Protein

Vitamin A is essential for vision and the growth/differentiation of almost all human organs.  Plasma retinol binding protein (RBP) is the principle and ...

Imaging Plasma Membrane Deformations With pTIRFM

Imaging Plasma Membrane Deformationer Med pTIRFM

To gain novel insights into the dynamics of exocytosis, our group focuses on the changes in lipid bilayer shape that must be precisely regulated during ...

Green Fluorescent Protein-based Expression Screening of Membrane Proteins in Escherichia coli

Green Fluorescent Protein-based Expression Screening of Membrane Proteins in Escherichia coli

Grönt fluorescerande protein-baserad expressions Screening av membranproteiner i<em&gt; Escherichia coli</em

The production of recombinant membrane proteins for structural and functional studies remains technically challenging due to low levels of expression and ...

Membrane Transport Processes Analyzed by a Highly Parallel Nanopore Chip System at Single Protein Resolution

Membrantransportprocesser analyseras av en hög grad parallella nanopore Chip System på Single Protein Upplösning

Membrane protein transport on the single protein level still evades detailed analysis, if the substrate translocated is non-electrogenic. Considerable ...

Determination of Plasma Membrane Partitioning for Peripherally-associated Proteins

Bestämning av plasmamembranet partitionering för perifert-associerade proteiner

This method provides a fast approach for the determination of plasma membrane partitioning of any fluorescently-tagged peripherally-associated protein ...