Name: measuring plasma membrane protein endocytic rates by reversible biotinylation
Uploaded: 2009-12-23T16:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Measuring Plasma Membrane Protein Endocytic Rates by Reversible Biotinylation at JoVE.com

Bu çalışma # DA15169 HEM hibe NIH tarafından finanse edildi

Usul Genel Bakış: Bu yaklaşımı kullanarak, hücre yüzey proteinleri kovalent (bkz. Şekil 1 kaçakçılığı kısıtlayıcı koşullar (düşük sıcaklık) altında bir Membran geçirgenliği olmayan, disülfit çiftli biyotinilasyon reaktifi (sulfo-NHS-SS-biotin) kullanarak ekstrasellüler lizin kalıntılarının biotin ile etiketlenir örnek olması için). Bir hücre kümesi kaçakçılığı izin şartlarına kaymıştır (37 ° C) ve biotinlenmiş proteinler içselleştirmek. Hü...

<ol>
	<li>Holton, K. L., Loder, M. K., Melikian, H. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nonclassical+distinct+endocytic+signals+dictate+constitutive+and+PKC-regulated+neurotransmitter+transporter+internalization.">Nonclassical distinct endocytic signals dictate constitutive and PKC-regulated neurotransmitter transporter internalization.</a> Nat Neurosci. 8, 881-888 (2005).</li><li>Boudanova, E., Navaroli, D. M., Melikian, H. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Amphetamine-induced+decreases+in+dopamine+transporter+surface+expression+are+protein+kinase+C-independent.">Amphetamine-induced decreases in dopamine transporter surface expression are protein kinase C-independent.</a> Neuropharmacology. 54, 605-612 (2008).</li><li>Boudanova, E., Navaroli, D. M., Stevens, Z., Melikian, H. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dopamine+transporter+endocytic+determinants:+carboxy+terminal+residues+critical+for+basal+and+PKC-stimulated+internalization.">Dopamine transporter endocytic determinants: carboxy terminal residues critical for basal and PKC-stimulated internalization.</a> Mol Cell Neurosci. 39, 211-217 (2008).</li><li>Loder, M. K., Melikian, H. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+dopamine+transporter+constitutively+internalizes+and+recycles+in+a+protein+kinase+C-regulated+manner+in+stably+transfected+PC12+cell+lines.">The dopamine transporter constitutively internalizes and recycles in a protein kinase C-regulated manner in stably transfected PC12 cell lines.</a> J Biol Chem. 278, 22168-22174 (2003).</li></ol>

Ortak sorunları: Bu deneylerde ortaya çıkan en sık karşılaşılan sorun, kötü şerit verimliliği . Şerit verimliliği sonuçları yorumlamak mümkün kritik. Şerit, son derece verimli olduğu sürece, içselleştirme şerit herhangi bir biotinlenmiş proteinler yüzeye içselleştirilmiş, aslında olduğu sonucuna varılması mümkün değildir. Şeritler ≥% 90 verimliliği en uygun olan ve şerit bu seviyenin altına düşerse herhangi bir sonuç atmak. Fakir bir şerit bir örnek Şekil 3&#39;te g...

measuring plasma membrane protein endocytic rates by reversible biotinylation

Plazma zarı proteinleri, reseptörler, iyon kanalları ve pompaları oluşan proteinlerin büyük bir, çeşitli grup. Faaliyet bu proteinlerin besin teslimat, hücresel heyecanlanma, kimyasal ve sinyalizasyon dahil olmak üzere önemli hücresel olayları, çeşitli sorumludur. Birçok plazma zarı proteinleri protein yüzey ekspresyonunu değiştirerek protein fonksiyonu modüle endositik kaçakçılığı, dinamik tarafından düzenlenir. Protein endositoz kolaylaştıracak mekanizmalar karmaşıktır ve birçok membran proteinlerinin tam olarak anlaşılmış değildir. Verilen bir protein endositik kaçakçılığı kontrol mekanizmaları tam olarak anlamak için, protein endositik oranı tam olarak ölçülebilir kritik öneme sahiptir. Birçok reseptörleri için doğrudan endositik hızı ölçümleri sıklıkla etiketli reseptör ligandlar kullanılarak elde edilir. Ancak, taşıyıcılar, pompalar ve iyon kanalları gibi birçok sınıflar, membran proteinlerinin, endositik hızını ölçmek için kullanılabilir uygun ligand var. Bu raporda, dopamin taşıyıcısı (DAT) endositik oranını ölçmek için kullandıkları bir geri dönüşümlü biyotinilasyon yöntemi açıklanmaktadır. Bu yöntem, içselleştirme oranlarını ölçmek için basit bir yaklaşım sağlar ve kolay bir çoğu membran proteinlerinin kaçakçılığı çalışmaları için istihdam edilebilir.

Watch this Scientific Journal Video about Measuring Plasma Membrane Protein Endocytic Rates by Reversible Biotinylation at JoVE.com

Measuring Plasma Membrane Protein Endocytic Rates by Reversible Biotinylation

Düzenlenmiş endositoz, hücre zarı proteinleri çoğunluğu yüzey ekspresyon düzeyleri yönetir. Burada, dopamin taşıyıcısı (DAT), polytopic membran proteini endositik hızını ölçmek için indirgenebilir, Membran geçirgenliği olmayan biyotinilasyon reaktifleri kullanmaktadır. Bu yöntem çoğu plazma membran proteinlerinin endositik oranını ölçmek için basit bir yaklaşımdır kolaylaştırır.

Tersinir biyotinilasyon Plazma Membran Protein endositik Oranları Ölçüm

Plasma membrane proteins are a large, diverse group of proteins comprised of receptors, ion channels, transporters and pumps.  Activity of these proteins ...

Research

JoVE Journal

Biology

Measuring Near Plasma Membrane and Global Intracellular Calcium Dynamics in Astrocytes

Astrositler Plazma Membran ve Küresel Hücre içi kalsiyum Dynamics civarında Ölçüm

The brain contains glial cells.  Astrocytes, a type of glial cell, have long been known to provide a passive supportive role to neurons. However, ...

Measuring the Induced Membrane Voltage with Di-8-ANEPPS

Di-8-ANEPPS ile İndüklenmiş Membran Gerilim Ölçme

Placement of a cell into an external electric field causes a local charge redistribution inside and outside of the cell in the vicinity of the cell ...

Quantitative Measurement of GLUT4 Translocation to the Plasma Membrane by Flow Cytometry

Akış Sitometri Plazma Membran GLUT4 Translokasyon Kantitatif Ölçüm

Glucose is the main source of energy for the body, requiring constant regulation of its blood concentration. Insulin release by the pancreas induces ...

Mapping Molecular Diffusion in the Plasma Membrane by Multiple-Target Tracing (MTT)

Mapping Molecular Diffusion in the Plasma Membrane by Multiple-Target Tracing MTT

Çoklu Hedef İzleme (MTT) tarafından Plazma Membran Moleküler Difüzyon Haritalama

Our goal is to obtain a comprehensive description of molecular processes occurring at cellular membranes in different biological functions. We aim at ...

Harvesting and Cryo-cooling Crystals of Membrane Proteins Grown in Lipidic Mesophases for Structure Determination by Macromolecular Crystallography

Makromoleküler Kristalografi tarafından Yapı Tayini için lipidik Mesophases Yetiştirilen Membran Proteinlerinin Hasat ve Cryo-soğutma Kristaller

An important route to understanding how proteins function at a mechanistic level is to have the structure of the target protein available, ideally at ...

Real-time Analyses of Retinol Transport by the Membrane Receptor of Plasma Retinol Binding Protein

Plazma Retinol Bağlayıcı Protein Membran Reseptör tarafından Retinol Ulaştırma Gerçek zamanlı Analizleri

Vitamin A is essential for vision and the growth/differentiation of almost all human organs.  Plasma retinol binding protein (RBP) is the principle and ...

Imaging Plasma Membrane Deformations With pTIRFM

PTIRFM ile görüntüleme Plazma Membran deformasyonlar

To gain novel insights into the dynamics of exocytosis, our group focuses on the changes in lipid bilayer shape that must be precisely regulated during ...

Green Fluorescent Protein-based Expression Screening of Membrane Proteins in Escherichia coli

Green Fluorescent Protein-based Expression Screening of Membrane Proteins in Escherichia coli

Membran proteinlerinin Yeşil floresan proteini temelli Ekspresyon elemesinde<em&gt; Escherichia coli</em

The production of recombinant membrane proteins for structural and functional studies remains technically challenging due to low levels of expression and ...

Membrane Transport Processes Analyzed by a Highly Parallel Nanopore Chip System at Single Protein Resolution

Membran Transport Tek Protein çözünürlükte Oldukça Paralel nanopore çip Sistemi Analiz Süreçleri

Membrane protein transport on the single protein level still evades detailed analysis, if the substrate translocated is non-electrogenic. Considerable ...

Determination of Plasma Membrane Partitioning for Peripherally-associated Proteins

Plazma zarı periferik ilişkili proteinler için bölümleme belirlenmesi

This method provides a fast approach for the determination of plasma membrane partitioning of any fluorescently-tagged peripherally-associated protein ...