Name: fluorescence activated cell sorting of plant protoplasts
Uploaded: 2010-02-18T17:30:00
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Ce travail a été soutenu par la National Science Foundation (subvention aucune. DBI 0.519.984) et le National Institutes of Health (subvention aucune. 5R01GM078279) ..

1) Préparation du matériel végétal <ol><li> Les protoplastes peuvent être dérivées de nombreuses espèces de plantes différentes et des tissus sous réserve que la bonne combinaison de la paroi cellulaire des enzymes digérant est utilisé 1. Avant une expérimentation à grande échelle est entreprise, une digestion à petite échelle de la matière est conseillé afin d&#39;évaluer l&#39;efficacité protoplastes du tissu, des enzymes, etc, et d&#39;estimer les cellules pour cent positif pour le t...

<ol>
	<li>Sheen, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Signal+transduction+in+maize+and+Arabidopsis+mesophyll+protoplasts.">Signal transduction in maize and Arabidopsis mesophyll protoplasts.</a> Plant Physiol. 127, 1466-1475 (2001).</li><li>Wysocka-Diller, J. W., Helariutta, Y., Fukaki, H., Malamy, J. E., Benfey, P. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+analysis+of+SCARECROW+function+reveals+a+radial+patterning+mechanism+common+to+root+and+shoot.">Molecular analysis of SCARECROW function reveals a radial patterning mechanism common to root and shoot.</a> Development. 127, 595-603 (2000).</li><li>Blilou, I., Xu, J., Wildwater, M., Willemsen, V., Paponov, I., Friml, J., Heidstra, R., Aida, M., Palme, K., Scheres, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+PIN+auxin+efflux+facilitator+network+controls+growth+and+patterning+in+Arabidopsis+roots.">The PIN auxin efflux facilitator network controls growth and patterning in Arabidopsis roots.</a> Nature. 433, 39-44 (2005).</li><li>Gifford, M. L., Dean, A., Gutierrez, R. A., Coruzzi, G. M., Birnbaum, K. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-specific+nitrogen+responses+mediate+developmental+plasticity.">Cell-specific nitrogen responses mediate developmental plasticity.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 105, 803-808 (2008).</li><li>Bargmann, B. O. R., Birnbaum, K. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Positive+fluorescent+selection+permits+precise,+rapid,+and+in-depth+overexpression+analysis+in+plant+protoplasts.">Positive fluorescent selection permits precise, rapid, and in-depth overexpression analysis in plant protoplasts.</a> Plant Physiol. 149, 1231-1239 (2009).</li><li>Petersson, S. V., Johansson, A. I., Kowalczyk, M., Makoveychuk, A., Wang, J. Y., Moritz, T., Grebe, M., Benfey, P. N., Sandberg, G., Ljung, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+Auxin+Gradient+and+Maximum+in+the+Arabidopsis+Root+Apex+Shown+by+High-Resolution+Cell-Specific+Analysis+of+IAA+Distribution+and+Synthesis.">An Auxin Gradient and Maximum in the Arabidopsis Root Apex Shown by High-Resolution Cell-Specific Analysis of IAA Distribution and Synthesis.</a> Plant Cell. 21, 1659-1668 (2009).</li></ol>

Les protoplastes peuvent, en principe, être dérivé d&#39;une variété de tissus végétaux, l&#39;optimisation des conditions favorables permettra d&#39;améliorer grandement la qualité et la quantité d&#39;ARN. Tant la solution protoplastes et le tampon d&#39;incubation élective utilisés auront une influence sur cet aspect. Beaucoup de différentes protéines fluorescentes peuvent être utilisés, selon les capacités de la FACS utilisé, par exemple, la GFP, RFP, YFP, CFP ...

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		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>250 &mu;m nylon mesh</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sefar Filtration</td>
<td>NITEX 03-250/50</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>100 &mu;m nylon mesh</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sefar Filtration</td>
<td>NITEX 03-100/47</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Square petri dishes</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fisher Scientific</td>
<td>08-757-10k</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Phytatrays</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>P1552</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Murashige and Skoog Basal Medium (MS)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>M5519</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>sucrose</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fisher Scientific</td>
<td>S5-3</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>MES</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>M2933</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>KOH</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>P1767</td>
<td>10 M stock</td>
</tr>
<tr>
<td>Eclipse 90i microscope</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Nikon</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Cellulase R-10</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Yakult Pharmaceutical</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Macerozyme R-10</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Yakult Pharmaceutical</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>D-mannitol</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>M9546</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>KCl</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>P8041</td>
<td>1 M stock</td>
</tr>
<tr>
<td>BSA</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>A3912</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>&beta;-mercaptoethanol</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>CALBIOCHEM</td>
<td>444203</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>CaCl2</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>C2536</td>
<td> 1 M stock</td>
</tr>
<tr>
<td>orbital shaker</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>LAB-LINE</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>40 &mu;m cell strainer</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>BD Falcon</td>
<td>352340</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>conical 15 ml tubes</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>BD Falcon</td>
<td>352196</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>table centrifuge</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sorvall</td>
<td>Legend RT</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>NaCl</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>S3014</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>FACSAria</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>BD</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>1.5 ml microfuge tubes</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>VWR</td>
<td>20170-38</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>RNeasy micro kit</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>QIAGEN</td>
<td>74004</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>WT-Ovation Pico RNA Amplification System</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>NuGEN</td>
<td>3300_12</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>FL-Ovation cDNA Biotin Module V2</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>NuGEN</td>
<td>4200_12</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

fluorescence activated cell sorting of plant protoplasts

Haute résolution, le type spécifique de cellules d&#39;analyse de l&#39;expression génique améliore considérablement la compréhension de la régulation du développement et des réponses aux stimuli de l&#39;environnement dans tout organisme multicellulaire. Hybridation in situ et la visualisation gène rapporteur peut dans une certaine mesure être utilisés à cette fin, mais pour une grande résolution quantitative RT-PCR ou haut-débit à l&#39;échelle d&#39;analyse du transcriptome à l&#39;isolement de l&#39;ARN à partir des types cellulaires particuliers sont requis. Cellulaire dissociation des tissus exprimant un marqueur fluorescent protein dans un type cellulaire spécifique et ultérieures de tri cellulaire par fluorescence (FACS), il est possible de collecter des quantités suffisantes de matériel pour l&#39;extraction d&#39;ARN, d&#39;ADNc analyse de synthèse / amplification et de biopuces. Un vaste ensemble de cellules spécifiques au type de lignes rapporteur fluorescent est disponible à la communauté scientifique des plantes. Dans ce cas, deux lignes de marqueur de la racine d&#39;Arabidopsis thaliana sont utilisées: P RCS:: GFP (endoderme et le centre de repos) et P WOX5:: GFP (centre de repos). Un grand nombre (des milliers) de jeunes plants sont cultivés en hydroponie ou sur plaques de gélose et d&#39;obtenir du matériel récolté assez de racines pour une analyse ultérieure. Cellulaire de dissociation de la matière végétale est obtenue par digestion enzymatique de la paroi cellulaire. Cette procédure permet l&#39;utilisation de haute osmolalité induite par plasmolyse et cellulases disponibles dans le commerce, pectinases et hémicellulases pour libérer protoplastes dans la solution. FACS de GFP-positives cellules permet l&#39;utilisation de la visualisation des verts contre les spectres d&#39;émission rouge de protoplastes excité par un laser à 488 nm. GFP-positives protoplastes peuvent être distingués par leur ratio est passé du vert à l&#39;émission de rouge. Les protoplastes sont généralement triés directement dans un tampon d&#39;extraction de l&#39;ARN et stockés pour un traitement ultérieur à une date ultérieure. Cette technique se révèle être simple et réalisable. Par ailleurs, il est démontré qu&#39;il peut être utilisé sans difficulté d&#39;isoler un nombre suffisant de cellules pour l&#39;analyse du transcriptome, même pour des types de cellules très rares (par exemple les cellules du centre de repos). Enfin, une installation de croissance des semis d&#39;Arabidopsis est démontré que le traitement permet simple des plantes avant de tri cellulaire (par exemple pour le type spécifique de cellules d&#39;analyse des réponses au stress biotiques ou abiotiques). Supplémentaires éventuelles utilisations des FACS des protoplastes végétaux sont discutées.

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Fluorescence Activated Cell Sorting of Plant Protoplasts

Une méthode pour isoler des types cellulaires spécifiques du matériel végétal est démontrée. Cette technique utilise des lignes de marqueur transgéniques exprimant des protéines fluorescentes dans des types cellulaires particuliers, cellulaire dissociation et de tri cellulaire activé par fluorescence. De plus, une installation de croissance est établi ici, qui facilite le traitement des<em&gt; Arabidopsis thaliana</em&gt; Semis avant le tri cellulaire.

Tri cellulaire activé par fluorescence des protoplastes végétaux

High-resolution, cell type-specific analysis of gene expression greatly enhances understanding of developmental regulation and responses to environmental ...

Research

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Biology

Generation of Human CD40-activated B cells

Génération de l&#39;homme CD40-B activés cellules

CD40-activated B cells (CD40-B cells) have been identified as an alternative source of immuno-stimulatory antigen-presenting cells (APC) for cancer ...

Recherche

Biologie

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Chromatographie d&#39;affinité lipidique des vésicules médiée utilisant magnétique tri cellulaire activé (LIMACS): une nouvelle méthode pour analyser les interactions protéines-lipides

The analysis of lipid protein interaction is difficult because lipids are embedded in cell membranes and therefore, inaccessible to most purification ...

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Bromodésoxyuridine (BrdU) l&#39;étiquetage et ultérieures de tri cellulaire activé par fluorescence de la culture indépendante Identification de carbone organique dissous dégradants bactérioplancton

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Analyse cellulaire spécifique de<em&gt; Arabidopsis</em&gt; Feuilles en utilisant la fluorescence par tri cellulaire activé

After initiation of the leaf primordium, biomass accumulation is controlled mainly by cell proliferation and expansion in the leaves1. However, the ...

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Optimisé méthodes de modélisation de coloration et de prolifération pour la surveillance division cellulaire en utilisant des colorants Suivi cellulaires

Fluorescent cell tracking dyes, in combination with flow and image cytometry, are powerful tools with which to study the interactions and fates of ...

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Interactions protéine-protéine visualisés par fluorescence bimoléculaire complémentation en protoplastes de tabac et des feuilles

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La mesure de la perméabilité à l&#39;eau Coefficient osmotique (P<sub&gt; F</sub&gt;) Des cellules sphériques: protoplastes de plantes isolées comme un exemple

Studying AQP regulation mechanisms is crucial for the understanding of water relations at both the cellular and the whole plant levels. Presented here is ...

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Visualisation Fréquence Stromule avec Fluorescence Microscopy

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