Name: primary culture and plasmid electroporation of the murine organ of corti.
Uploaded: 2010-02-04T00:00:00
Duration: 12 min 29 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Primary Culture and Plasmid Electroporation of the Murine Organ of Corti. at JoVE.com

De auteurs willen graag Demêmes Danielle en Douglas Cotanche bedanken en voor hun inzet in het onderwijs ons de methoden voor de isolatie van het orgaan van Corti. Daarnaast willen we bedanken Ismaël Stefanov-Wagner voor engineering van de electroporator elektroden, Sherry Lin voor haar bijdrage kunstwerk aan de video-animatie, en Matthew Chana, Jason Meeker en Kendra Marshall ( <a href="http://www.goodfightproductions.com">www.goodfightproductions.com</a> ) voor het produceren van de video. Dit werk werd gefinancierd door subsidies (R03DC010065-Parker, RO1DC007174-Edge; P30DC05209-MEEI Core Ondersteuning voor Hearing Research) van de NIDCD, toont.

Dag 1. Sterilisatie en coaten van glas dekglaasjes. <ol><li> Droog steriliseren glas microscoop dekglaasjes in een autoclaaf. </li><li> Plaats de gesteriliseerde dekglaasjes in twee putten van een pre-gesteriliseerde vier-en celcultuur schotel. </li><li> Coat de dekglaasjes met 1:1 poly-L-ornithine en laminine aangevuld met 20% foetaal runderserum (FBS) overnacht bij 4 ° C. <ol class="lalpha"><li> 400 pi poly-L-ornithine (0,01% oplossing bewaard bij 4 ° C) </li><li> 400 pi laminine (50 ug / ml stockoplossing opgeslagen in porties bij -20 ° C) </li><li> 200 pi FBS (opgeslagen in porties bij -20 ° C) </li></ol></li><li> Warmte-steriliseren van de dissectie-instrumenten &#39;s nachts in een 150 ° C incubator. </li><li> Maak kweekmedium dat 10% serum en 10 mg / ml ampicilline. <ol class="lalpha"><li> 90 ml Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium </li><li> 5 ml FBS (opgeslagen in porties bij -20 ° C) </li><li> 5 ml paard serum (opgeslagen in porties bij -20 ° C) </li><li> 10 pi ampicilline (10 mg / ml voorraadoplossing bewaard bij 4 ° C) </li></ol></li></ol> Dag 2. Isolatie van het orgaan van Corti. <ol><li> Steriliseer de positieve stroom dissectie kap. <ol class="lalpha"><li> zetten UV-licht gedurende 20 minuten </li><li> spuiten alle oppervlakken met 70% ethanol en wacht 5 minuten voor gebruik. </li></ol></li><li> Onthoofden muis pup (P4) aan de basis van het foramen magnum met behulp van operationele schaar. </li><li> Kort spoel het hoofd in 10 cm schotel met 70% ethanol. </li><li> Verwijder de opperhuid met behulp van een scalpel. </li><li> Open de schedel langs de pijlnaad met behulp van een scalpel en dan halveren de voorhersenen. Bewaar de caudale voorhersenen voor verdere dissectie. </li><li> Verwijder de voorhersenen, de kleine hersenen en de hersenstam met stompe dissectie. </li><li> Verwijder de tijdelijke botten (fig. 2A), dompel ze kort in 70% ethanol, en breng ze naar een 3 mm schotel met steriele HBSS. </li><li> Met behulp van een tang, verwijder de bulla en het omliggende weefsel van de petrous gedeelte van het slaapbeen. </li><li> Zoek de schelp vorm slakkenhuis (fig. 2B) en scheiden van het vestibulaire systeem met behulp van een tang. </li><li> In deze fase van ontwikkeling, is het benige labyrint niet volledig verkalkt en is gemakkelijk te ontleed met behulp van een tang. Verwijder het benige labyrint van het slakkenhuis door een zorgvuldige scheiding te beginnen bij de basale einde en bewegende apicaal met behulp van een tang. </li><li> De spiraal ligament en de bijgevoegde orgaan van Corti is opgerold langs de spiraal van de modiolus (fig. 2C). Verwijder voorzichtig het orgaan van Corti door het veiligstellen van de spiraal ligament aan de haak gebied van de basis met behulp van pincet en tot rust te komen als je beweegt apicaal. </li><li> Beginnend bij de basis, verwijdert u de spiraal ligament van het orgaan van Corti met behulp van # 55 fijn pincet (fig. 2D). Micro-isolatie van het orgaan van Corti sensorische epitheel (optioneel). </li><li> Verwijder het orgaan van Corti haak regio van de bodem met behulp van twee ½ cc insuline-injectiespuiten met permanent bevestigde U-100 28G ½ naalden als tang. </li><li> Vanaf de top, verwijder de spiraal limbus van de rij binnenste haarcellen en ga verder basaal (fig. 2E-F). Plating het orgaan van Corti explantatie </li><li> Haal de poly-L-ornithine/laminin/FBS oplossing uit de cultuur putten en voeg 130 ul van de cultuur medium. </li><li> Breng de ontleed orgaan van Corti aan de gecoate glas dekglaasje in de cultuur goed en oriënteren van de explantatie, zodat de cilia van de haarcellen naar boven wijzen. </li><li> Verwijder het medium in de cultuur goed met behulp van een 200 pi pipet. Zorg ervoor dat het basilair membraan stevig contact maakt met het gecoat glas dekglaasje aan. </li><li> Voeg voorzichtig 130 pi kweekmedium aan het orgaan van Corti met behulp van een 200 ml pipet. Van toepassing zijn twee druppels op het oppervlak van het orgaan van Corti en dan langzaam de resterende volume toe te voegen aan de zijkant van de dekglaasje aan. Zorg ervoor dat het orgaan van Corti niet zweven in de cultuur media, maar blijft aangebracht op het dekglaasje. </li><li> Incubeer overnacht bij 37 ° C in de aanwezigheid van 5% CO 2. </li></ol> Dag 3. Elektroporatie van de reporter-gen in gekweekte orgaan van Corti. <ol><li> Verwijder het kweekmedium van het orgaan van Corti cultuur. </li><li> Voeg 130 uL H 2 O voor 1 minuut en daarna verwijderen met behulp van een 200 pi pipet. </li><li> Voeg 30 ul van DsRed reporter plasmide (2 mg / ml H 2 O opgeslagen bij -20 ° C). </li><li> Vooraf de elektroden van de electroporator met behulp van een micromanipulator, zodat de anode eennd kathode zijn aan beide kanten van de cultuur. </li><li> Genereer een puls (27V, 30 ms duur, 10 pulsreeksen) om het reportergen electroporate in het orgaan van Corti explantatie cultuur. <ol class="lalpha"><li> Optioneel: de polariteit van de pols houden om elektroporatie van het transgen zorgen op zowel de modiolar en de spiraal ligament zijden van de explantatie. </li></ol></li><li> Wacht 5 minuten. </li><li> Voeg 130 ul van de Fugene 6: DNA-oplossing (3 delen Fugene tot 2 delen DNA). Deze oplossing moet voorafgaand aan de start van de elektroporatie procedure (stap 20) met behulp van een 3 ml ronde bodem polystyreen reageerbuis in een laminaire stroming kap worden voorbereid. Om deze oplossing te maken: <ol class="lalpha"><li> Voeg 2,4 ul van Opti-MEM (opgeslagen bij 4 ° C) om de reageerbuis. </li><li> Voeg 0,6 ul van Fugene 6 reagens (opgeslagen bij 4 ° C) om de reageerbuis. Zorg ervoor dat de Fugene direct toe te voegen aan de Opti-MEM en direct contact met de zijkanten van de reageerbuis te vermijden. </li><li> Vortex gedurende 1 seconde. </li><li> Incubeer 5 minuten bij kamertemperatuur. </li><li> Voeg 2,0 ul DsRed reporterplasmide dubbelstrengs DNA (opgeslagen bij -20 ° C bij 100 ug DNA / ml H 2 O monsters). </li><li> Vortex gedurende 1 seconde. </li><li> Incubeer 15 minuten bij kamertemperatuur. </li><li> Voeg 200 ul van kweekmedium. </li><li> Vortex gedurende 1 seconde. </li></ol></li><li> Incubeer overnacht bij 37 ° C in 5% CO 2. </li><li> Voeg 2 mL kweekmedium aan de cultuur goed en incubeer 37 ° C gedurende maximaal 10 dagen. </li></ol> Representatieve resultaten We presenteren een methode voor de isolatie van het orgaan van Corti van een perinatale muis. De procedure kan worden gebruikt voor muizen zo jong als embryonale dag 16 tot ongeveer postnatale dag 6, op welk punt de benige labyrint voldoende wordt verkalkte te maken van de dissectie omslachtig. Zodra het orgaan van Corti is ontleed, kan het worden uitgeplaat en gekweekt hetzij in haar geheel (fig 3) of als micro-geïsoleerde sensorische epitheel (fig 4). We hebben verder presenteerde een techniek om exogene genen tot expressie in de gekweekte orgaan van Corti. De organotypische cultuur is geschikt voor veel andere soorten onderzoek, zoals de analyse van het orgaan van Corti genexpressie met behulp van RT-PCR of in situ hybridisatie, het orgaan van Corti co-cultuur met spiraal ganglion cellen of exogene stamcellen met behulp van de micro-isoleren 3, of in vitro analyse van haar cel dood en regeneratie. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/1685/1685fig1.jpg"><img src="/files/ftp_upload/1685/1685fig1tmb.jpg" alt="Figuur 1" border="0" /></a> Figuur 1. Doorsnede van de P4 muriene orgaan van Corti. (A) Een dwarsdoorsnede van de basale begin van een cryosectioned cochlea verkregen uit een P4 muis illustreert de algemene structuren van de muis cochlea beschreven in dit protocol. De scala media wordt begrensd door de spiraal ligament en stria vascularis lateraal, de Reissner s membraan superiorly, de spiraal limbus mediaal, en het basilair membraan inferiorly. De doos aangegeven de regio uitgebreid in B. (B) Het orgaan van Corti bevindt zich aan de superieure kant van het basilair membraan en bevat een rij binnenste haarcellen, drie rijen buitenste haarcellen, en hun respectieve ondersteunende cellen. Onderbroken lijn 1 geeft de locatie langs het basilair membraan dat is verwijderd tijdens dit orgaan van Corti dissectie. Onderbroken lijn 2 geeft de locatie langs het basilair membraan dat is verwijderd tijdens de micro-isolatie procedure. Groen geeft aan immunohistochemische kenmerken van calbindin, die interdentale cellen van de spiraal limbus, cochleaire haarcellen, spiraal ganglion neuronen, maar ook cellen van de spiraal ligament en stria vascularis 7 labels. DAPI de etikettering van kernen is in het blauw. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/1685/1685fig2.jpg"><img src="/files/ftp_upload/1685/1685fig2tmb.jpg" alt="Figuur 2" border="0" /></a> Figuur 2. Orgaan van Corti dissectie. Beelden uit de bijbehorende video van het orgaan van Corti dissectie highlight A) van de cochlea en het evenwichtsorgaan zich in het geïsoleerde slaapbeen (rood), B), de benige labyrint van het slakkenhuis, C) de spiraal ligament en de bijgevoegde orgaan van Corti na het verwijderen van het benige labyrint, D) het verwijderen van de spiraal ligament en stria vascularis (rood) van het orgaan van Corti, E) micro-isolatie van de sensorische epitheel van de spiraal limbus (rood), en F) van de geïsoleerde spiraal limbus (links) en sensorische epitheel (rechts). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/1685/1685fig3.jpg"><img src="/files/ftp_upload/1685/1685fig3tmb.jpg" alt="Figuur 3" border="0" /></a> Figuur 3. Gekweekte orgaan van Corti explant. DIC afbeelding met het orgel vanCorti van een P4 Atoh1-nGFP muis die geïsoleerd, verzilverd, en gekweekt werd vijf dagen zoals beschreven. Deze muis is genetisch zo gebouwd dat cellen die de pro-haarcel gen Atonal homoloog 1 (Atoh1 aka Math1) vertonen een groen fluorescerend eiwit dat is gelokaliseerd aan de kern 8. De organen van Corti van deze muizen vertonen een nucleaire GFP label in alle haar celkernen en daardoor zorgen voor eenvoudige visualisatie van de sensorische epitheel met behulp van een epifluorescerende microscoop. De relatief grote spiraal limbus kan worden gezien lateraal van de sensorische epitheel. Mesenchymale cellen die afkomstig zijn van het orgaan van Corti zijn weg gemigreerd van het explantatie. Blauwe nucleaire label is DAPI. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/1685/1685fig4.jpg"><img src="/files/ftp_upload/1685/1685fig4tmb.jpg" alt="Figuur 4" border="0" /></a> Figuur 4. Micro-geïsoleerde sensorische epitheel. Epifluorescerende beeld verkregen van de zintuiglijke epitheel dat is geïsoleerd uit een P4 muriene orgaan van Corti, zoals beschreven en overnacht gekweekt. De micro-isolaat werd vervolgens in 4% paraformaldehyde en verwerkt voor immunokleuring van myosine 7a die cochleaire haarcellen labels. Let op de afwezigheid van de relatief grotere spiraal limbus uit de figuur 3. Blauwe nucleaire label is DAPI. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/1685/1685fig5.jpg"><img src="/files/ftp_upload/1685/1685fig5tmb.jpg" alt="Figuur 5" border="0" /></a> Figuur 5. Elektroporatie van DsRed reportergen in de gekweekte orgaan van Corti. Hele organen van Corti van P4 Atoh1-nGFP muis pups werden geïsoleerd, beplaat, en vervolgens geëlektroporeerd met de DsRed reporter-gen, zoals beschreven en vervolgens bekeken onder een microscoop epifluorescerende. Cellen van het orgaan van Corti Explantatie dat de transgene DsRed reporter eiwit uitgedrukt vertonen een rode fluorescentie en endogene cellen van de sensorische epitheel vertonen een groene nucleaire fluorescentie. Transgene cellen kan worden gezien in de spiraal limbus en sensorische epitheel.

<ol>
	<li>Sobkowicz, H. M., Bereman, B., Rose, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organotypic+Development+of+the+Organ+of+Corti+in+Culture.">Organotypic Development of the Organ of Corti in Culture.</a> Journal of Neurocytology. 119 (4), 543-543 (1975).</li><li>Zheng, J. L., Gao, W. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Overexpression+of+Math1+induces+robust+production+of+extra+hair+cells+in+postnatal+rat+inner+ears.">Overexpression of Math1 induces robust production of extra hair cells in postnatal rat inner ears.</a> Nature Neuroscience. 3 (6), 580-580 (2000).</li><li>Martinez-Monedero, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=THE+POTENTIAL+ROLE+OF+ENDOGENOUS+STEM+CELLS+IN+REGENERATION+OF+THE+INNER+EAR.">THE POTENTIAL ROLE OF ENDOGENOUS STEM CELLS IN REGENERATION OF THE INNER EAR.</a> J Neurobiol. 66 (4), 319-319 (2006).</li><li>Saffer, L. D., Gu, R., Corwin, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+RT-PCR+analysis+of+mRNA+for+growth+factor+receptors+in+damaged+and+control+sensory+epithelia+of+rat+utricles.">An RT-PCR analysis of mRNA for growth factor receptors in damaged and control sensory epithelia of rat utricles.</a> Hearing Research. 94 (1,2), 14-14 (1996).</li><li>Zhang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation,+growth+and+differentiation+of+hair+cell+progenitors+from+the+newborn+rat+cochlear+greater+epithelial+ridge.">Isolation, growth and differentiation of hair cell progenitors from the newborn rat cochlear greater epithelial ridge.</a> Journal of Neuroscience Methods. 164 (2), 271-271 (2007).</li><li>Jones, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibitors+of+Differentiation+and+DNA+Binding+(Ids)+Regulate+Math1+and+Hair+Cell+Formation+during+the+Development+of+the+Organ+of+Corti.">Inhibitors of Differentiation and DNA Binding (Ids) Regulate Math1 and Hair Cell Formation during the Development of the Organ of Corti.</a> J. Neurosci. 26 (2), 550-550 (2006).</li><li>Daniela, B., Josef, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calbindin+and+S100+protein+expression+in+the+developing+inner+ear+in+mice.">Calbindin and S100 protein expression in the developing inner ear in mice.</a> The Journal of Comparative Neurology. 513 (5), 469-469 (2009).</li><li>Helms, A. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autoregulation+and+multiple+enhancers+control+Math1+expression+in+the+developing+nervous+system.">Autoregulation and multiple enhancers control Math1 expression in the developing nervous system.</a> Development. 127 (6), 1185-1185 (2000).</li><li>Zheng, J. L., Wei-Qiang, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+Damage+to+Auditory+Neurons+and+Hair+Cells+by+Ototoxins+and+Neuroprotection+by+Specific+Neurotrophins+in+Rat+Cochlear+Organotypic+Cultures.">Differential Damage to Auditory Neurons and Hair Cells by Ototoxins and Neuroprotection by Specific Neurotrophins in Rat Cochlear Organotypic Cultures.</a> European Journal of Neuroscience. 8 (9), 1897-1897 (1996).</li></ol>

Er zijn verschillende details die essentieel zijn voor het succes van deze procedure. Hoe korter de tijd van slaapbeen isolatie tot orgaan van Corti incubatie, hoe groter de kans dat de organen zal hechten aan het dekglaasje en resulteren in levensvatbare orgaan culturen. Daarom is het belangrijk om de hoeveelheid van de termijn tussen de dissectie en het plaatsen van de organen in de couveuse. De keuze van antibiotica is ook van cruciaal belang, omdat veel aminoglycoside-antibiotica zijn ototoxische en zal resulteren in het haar celdood. Hoewel het de voorkeur om het gebruik van antibiotica helemaal af te zien, dit laat de mogelijkheid open voor de verontreiniging. Daarom raden we het gebruik van 10 ug / ml ampicilline als algemene regel om mogelijke besmetting problemen te overwinnen. Het meest lastige aspect van deze, en andere procedures voor de primaire cultuur van het orgaan van Corti, is de neiging van de organen te drijven af ​​van de platen tijdens de incubatie. Hoewel de drijvende orgel culturen kunnen levensvatbaar blijven voor 5-7 dagen, zijn er nadelen van het kweken van drijvende organen. Bijvoorbeeld, drijvende orgel culturen vaak folden op zich na 4-5 dagen rendering microscopie problematisch. Vervolgens kan de structurele integriteit van het orgaan worden aangetast in vergelijking met de organen die zijn aangebracht op het dekglaasje. We hebben gevonden dat de volgende technieken helpen om ervoor te zorgen dat het orgaan van Corti niet zweven in de cultuur media, maar blijft aangebracht op de dekglaasje aan. De eerste, de vacht van de glazen dekglaasjes in 1:1 polyornithine / laminine aangevuld met 20% FBS zoals beschreven. De overnacht incubatie gevraagd in dit protocol is de minimale tijd dat de plaat zou moeten worden bekleed. In ons laboratorium hebben we vaak jas al de platen die we nodig hebben voor een week en houd ze bij 4 ° C tot de dag voorafgaand aan het gebruik als we ze naar de incubator voor een incubatie gedurende de nacht. Ten tweede, na de organen worden getransporteerd naar de gecoate dekglaasjes, oriënteren de explantatie, zodat de cilia van de haarcellen naar boven. Deze oriëntatie zal de hechting van het basilair membraan naar de cultuur schotel. Ten derde, verwijdert u de media in de put aan te brengen de explantatie aan de beklede schaal. Dit zal zorgen voor contact tussen de cultuur schotel en het basilair membraan en vergroten het vermogen van de explantaten zich te houden aan het glas. Dit zal ook helpen bij het handhaven van de structurele integriteit van de rijen van de haarcellen. Ten slotte is zorgvuldig drip twee druppels kweekmedium op het oppervlak van het orgaan van Corti met behulp van een 200 pi capaciteit pipet en dan langzaam de put te vullen door druppelen de resterende volume (van de totaal 130 pi) aan de kant van het dekglaasje. Het is belangrijk om snel te werken aan de bevestiging van het orgaan van Corti, verzekeren het gecoate dekglaasje aan. Uit de inleiding van de dissectie van de incubatie van de explantaten, duurt het normaal gesproken 10 minuten voor een geoefend operator klaar zijn met dit orgaan van Corti isolatie procedure. In dit protocol, presenteren we ook een methode voor de micro-isolatie van de sensorische epitheel van de spiraal limbus van het orgaan van Corti. In deze procedure is de spiraal limbus weg ontleed van de zintuiglijke epitheel met behulp van 28G ½ insuline naalden als dissectie-instrumenten. De resulterende micro-isoleren bestaat uit de rijen van de haarcellen en de bijbehorende ondersteunende cellen (fig 3). De geïsoleerde sensorische epitheel kan dan worden gekweekt, zoals beschreven in dit protocol. Deze micro-isolatie procedure moet worden vergeleken met de enzymatische scheiding van de sensorische epitheel van het omringende weefsel 4. Bij zoogdieren, maar ook niet-zoogdieren, zoals kippen, thermolysine vertering van geïsoleerde vestibulaire organen resulteert in de isolatie van sensorische epitheel van de kelder mesenchymale cellen 4. In de rat slakkenhuis, thermolysine spijsvertering resulteert in de scheiding van de grotere epitheliale nok, in mindere epitheliale nok en bijbehorende sensorische epitheel van de kelder membraan 5. Het is echter onduidelijk of de cochleaire sensorische epitheel kan hechten aan de gecoate platen zonder de bijbehorende mesenchymale cellen. Terwijl zowel de mechanische micro-isolatie-methode en enzymatische vertering methode resulteert in de scheiding van de sensorische epitheel van de spiraal limbus, de voordelen van de micro-isoleren dissectie over de thermolysine spijsvertering zijn een relatief kortere protocol, goedkoper reagentia, en mogelijk minder stress de explantaat als gevolg van enzymatische werking van de spijsvertering. Daarnaast is de basale membraan intact gelaten in deze aanpak, die bevestiging van de sensorische epitheel van de cultuur plaat te verbeteren. Nadelen van deze methode zijn de noodzaak om de vaardigheden te ontwikkelen voor deze delicate dissectie en mogelijke mechanische schade aan de sensorische epitheel als gevolg van de micro-dissectie. Als voorbeeld van het nut van deze procedure, presenteren we ook een voorbeeld van het gebruik van het orgel van deCorti culturen, de elektroporatie van exogene genen in de explantaat cultuur. De elektroporatie hierboven beschreven procedure is gebaseerd op de vorige methoden van orgaan van Corti elektroporatie. Met name Zheng en Gao (2000) beschrijven de elektroporatie van geïsoleerde rat organen van Corti, waar de explantaten op hun plaats gehouden voor elektroporatie door een gevormde groef van agarose en vervolgens uitgeplaat op collageen gecoate 8-goed LabTek slide in serum-vrij medium 2. Een voordeel van hun aanpak is dat de organen zo zijn gericht dat de bovenste oppervlakken van de explantaten de kathode, die theoretisch zou moeten resulteren in een gelijkmatige verdeling van geëlektroporeerde cellen over de explantatie gezicht. In onze handen echter, de methode die we beschrijven verbeterd op deze procedure, omdat het orgaan van Corti bleef aangebracht op de dekglaasje gedurende de procedure waardoor de manipulatie van de explantaat na elektroporatie. Daarnaast bleef een hoger percentage van organen van Corti aan de dekglaasjes het gebruik van deze methode gepresenteerd. Onze methode is afkomstig uit Jones, et al.. (2006), die de toevoeging van de Fugene 6 reagens gebruikt om de efficiëntie van genexpressie toenemen na de elektroporatie. In de Jones et al.. (2006) protocol, zijn de organen geëlektroporeerd, geïncubeerd gedurende 5 minuten met 100 pi van Fugene 6 transfectiereagens, en vergulde 6. Onze methode verschilt in het gebruik van een 3:2 verhouding van Fugene 6 reagens om plasmide DNA, die vonden we empirisch een optimale transgene expressie te bieden met een minimum aan orgaantoxiciteit. Wij gebruiken geen onverdund Fugene 6 reagens, wat kan leiden tot toxiciteit voor de culturen. De elektrode configuratie in ons protocol, evenals Jones et al.. (2006), resulteert in een lagere expressie van genen in zowel de spiraal limbus of zintuiglijke epitheel, afhankelijk van de positie van de kathode. Hoewel er DsRed positieve cellen aan de kant van de cultuur verre naar de kathode, is er een hogere concentratie van de transgene cellen dichter bij de kathode. Om ervoor te zorgen een volledige expressie van het transgen in beide zijden van het orgaan van Corti Explantatie, kan de stroom worden omgekeerd voor een tweede puls trein door simpelweg het omkeren van de leads. De gepresenteerde protocol resulteert in een robuuste expressie van het transgen door het orgaan van Corti (fig. 5).

<table border="1">
	<thead>
		<tr>
			<th>Material Name</th>
			<th>Type</th>
			<th>Company</th>
			<th>Catalogue Number</th>
			<th>Comment</th>
		</tr>
	</thead>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Glass microscope coverslips</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>DYNALAB Corporation (Rochester, NY)</td>
			<td>2010</td>
			<td>10mm diameter, circle #1, 1mm thickness, 1 ounce</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4 ringed cell culture dish</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>Greiner Bio-One (Frickenhausen, Germany)</td>
			<td>627170</td>
			<td>Sterilized 35 X 10 mm cell culture dish with 4 inner rings</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-L-ornithine</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>Sigma-Aldrich Company (St. Louis, MO)</td>
			<td>P4957</td>
			<td>0.01% Solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laminin</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>BD Biosciences (Franklin Lakes, NJ) </td>
			<td>354232</td>
			<td>made in mouse</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>Invitrogen (Carlsbad, CA)</td>
			<td>26140-095</td>
			<td>Qualified</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Operating scissors</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>Roboz Surgical Instrument Co. (Gaithersburg, MD)</td>
			<td>RS-6806</td>
			<td>Straight, sharp-blunt length 5"</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>#11 Scalpel Blade</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>Becton Dickenson (Franklin Lakes, NJ)</td>
			<td>372611</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>#4 Dumoxel forceps</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>Fine Science Tools (Foster City, CA)</td>
			<td>11241-30</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>#55 Dumostar fine forceps</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>Fine Science Tools (Foster City, CA)</td>
			<td>11295-51</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco's Modified Eagle Medium </td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>Invitrogen (Carlsbad, CA)</td>
			<td>10564-011</td>
			<td>High Glucose</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Horse Serum</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>Invitrogen (Carlsbad, CA)</td>
			<td>2605088</td>
			<td>Heat Inactivated</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ampicillin Sodium Salt </td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>Invitrogen (Carlsbad, CA)</td>
			<td>11593-027</td>
			<td>Irradiated</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&frac12; cc Lo-Dose Insulin Syringe </td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>Becton Dickenson (Franklin Lakes, NJ)</td>
			<td>329465</td>
			<td>U-100 28G&frac12;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fugene 6 Transfection Reagent</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>Roche (Mannheim, Germany)</td>
			<td>11-815-091-001</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polystyrene test tube</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>Fisher Scientific (Pittsburgh, PA)</td>
			<td>14-956-5A</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laminar flow hood</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>The Baker Company (Stanford, ME)</td>
			<td>Model SG603a</td>
			<td>SterileGARD III 
				Advanced Class II 
				Biological Safety Cabinet</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Opti-MEM I Reduced-Serum Medium</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>Invitrogen (Carlsbad, CA)</td>
			<td>31985</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reporter plasmid</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>Clontech (Mountain View, CA)</td>
			<td>632539</td>
			<td>pCMV DsRed-Express 2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electroporator</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>BioRad (Hercules, CA)</td>
			<td>165&#x2013;2662</td>
			<td>BioRad Gene Pulser Xcell</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

primary culture and plasmid electroporation of the murine organ of corti. 

In alle zoogdieren, is de sensorische epitheel voor auditie gelegen langs de spiraalvormige orgaan van Corti, dat zich bevindt binnen de schelp gevormd slakkenhuis van het binnenoor (fig. 1). Haarcellen in het slakkenhuis te ontwikkelen, die de mechanosensorische cellen van het auditieve systeem, zijn afgestemd op een rij binnenste haarcellen en drie (in de basis-en mid-bochten) tot vier (in de apicale beurt) rijen buitenste haarcellen dat overspanning de lengte van het orgaan van Corti. Haarcellen transduceren sound-geïnduceerde mechanische trillingen van het basilair membraan in de neurale impulsen die de hersenen kunnen interpreteren. De meeste gevallen van perceptief gehoorverlies worden veroorzaakt door dood of disfunctie van cochleaire haarcellen. Een steeds belangrijker instrument in auditieve onderzoek is de isolatie en in vitro cultuur van het orgel explantaat 1,2,9. Eenmaal geïsoleerd, kan de explantaten worden gebruikt in verschillende manieren om informatie met betrekking tot normatieve, afwijkend, of therapeutische fysiologie te geven. Genexpressie, stereocilia motiliteit, cel-en moleculaire biologie, evenals biologische benaderingen voor haar celregeneratie zijn voorbeelden van experimentele toepassingen van orgaan van Corti explantaten. Dit protocol beschrijft een methode voor de isolatie en de cultuur van het orgaan van Corti van neonatale muizen. De bijgaande video bevat stapsgewijze aanwijzingen voor de isolatie van het slaapbeen van muis pups, en de daaropvolgende isolatie van de cochlea, spiraal ligament, en orgaan van Corti. Eenmaal geïsoleerd, kan de zintuiglijke epitheel worden uitgeplaat en gekweekt in vitro in zijn geheel, of als een verdere ontleed micro-isolaat dat mist de spiraal limbus en spiraal ganglion neuronen. Met behulp van deze methode kan de primaire explantaten worden gehandhaafd voor 7-10 dagen. Als voorbeeld van het nut van deze procedure, zal orgaan van Corti explanten worden geëlektroporeerd met een exogene DsRed reportergen. Deze methode biedt een verbetering ten opzichte van andere gepubliceerde methoden omdat het reproduceerbaar, eenduidig, en stapsgewijze aanwijzingen voor de isolatie, microdissectie, en primaire cultuur van het orgaan van Corti.

Watch this Scientific Journal Video about Primary Culture and Plasmid Electroporation of the Murine Organ of Corti. at JoVE.com

Primary Culture and Plasmid Electroporation of the Murine Organ of Corti.

Deze procedure beschrijft een methode voor de isolatie en de cultuur van het muriene orgaan van Corti, met of zonder de spiraal limbus en spiraal ganglion neuronen. We tonen ook aan een methode voor de expressie van een exogeen reportergen in het orgaan van Corti explant door elektroporatie.

Primaire Cultuur en Plasmide Elektroporatie van de muizen orgaan van Corti.

In all mammals, the sensory epithelium for audition is located along the spiraling organ of Corti that resides within the conch shaped cochlea of the ...

Research

JoVE Journal

Biology

Primary Culture and Plasmid Electroporation of the Murine Organ of Corti. 

Electroporation of Mycobacteria

Elektroporatie van mycobacteriën

High efficiency transformation is a major limitation in the study of mycobacteria. The genus Mycobacterium can be difficult to transform; this is mainly ...

The Preparation of Primary Hematopoietic Cell Cultures From Murine Bone Marrow for Electroporation

De vervaardiging van primaire hematopoietische cellen culturen uit Murine Bone Marrow voor Elektroporatie

It is becoming increasingly apparent that electroporation is the most effective way to introduce plasmid DNA or siRNA into primary cells. The Gene Pulser ...

Primary Culture of Adult Rat Heart Myocytes

Primaire Cultuur van volwassen ratten Heart myocyten

Cultured primary adult rodent heart cells are an important model system for cardiovascular research.  Nevertheless, establishment of robust, viable ...

Isolation and Primary Culture of Rat Hepatic Cells

Isolatie en Primaire Cultuur van Rat levercellen

Primary hepatocyte culture is a valuable tool that has been extensively used in basic research of liver function, disease, pathophysiology, pharmacology ...

Isolation and Culture of Mouse Primary Pancreatic Acinar Cells

Isolatie en Cultuur van de Muis Primaire Pancreatic Acinaire Cells

This protocol permits rapid isolation (in less than 1 hr) of murine pancreatic acini, making it possible to maintain them in culture for more than one ...

Isolation and Primary Culture of Mouse Aortic Endothelial Cells

Isolatie en Primaire Cultuur van de muis endotheelcellen

The vascular endothelium is essential to normal vascular homeostasis. Its dysfunction participates in various cardiovascular disorders. The mouse is an ...

Fat Body Organ Culture System in Aedes Aegypti, a Vector of Zika Virus

Fat Body Organ Culture System in Aedes Aegypti, a Vector of Zika Virus

Vet orgel cultuur lichaamssysteem in Aedes Aegypti, een Vector van Zika-Virus

The insect fat body plays a central role in insect metabolism and nutrient storage, mirroring functions of the liver and fat tissue in vertebrates. Insect ...

Novel Method of Plasmid DNA Delivery to Mouse Bladder Urothelium by Electroporation

Nieuwe methode van plasmide DNA levering aan muis blaas Urothelium door Electroporation

Genetically engineered mouse models (GEMMs) are extremely valuable in revealing novel biological insights into the initiation and progression mechanisms ...

Primary Culture of Rat Adrenocortical Cells and Assays of Steroidogenic Functions

Primaire cultuur van Rat Adrenocortical cellen en testen van Steroidogenic functies

The hormone which the adrenal cortex secretes is vital for animals against stress and diseases. The method described here is the procedure of primary ...

Isolation and Culture of Primary Aortic Endothelial Cells from Miniature Pigs

Isolatie en cultuur van primaire aorta-endotheel cellen van miniatuur varkens

Xenotransplantation is a promising way to resolve the shortage of human organs for patients with end-stage organ failure, and the pig is considered as a ...