Name: primary culture and plasmid electroporation of the murine organ of corti.
Uploaded: 2010-02-04T00:00:00
Duration: 12 min 29 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Primary Culture and Plasmid Electroporation of the Murine Organ of Corti. at JoVE.com

המחברים מבקשים להודות Demêmes דניאל דאגלס Cotanche ועל מאמציהם מלמד אותנו את השיטות לבידוד של האיבר של קורטי. בנוסף, אנו רוצים להודות ישמעאל Stefanov-וגנר להנדסת האלקטרודות electroporator: שרי לין עבור יצירות אמנות תורם לה אנימציה וידאו, ומתיו חנה, ג&#39;ייסון מיקר, ו קנדרה מרשל ( <a href="http://www.goodfightproductions.com">www.goodfightproductions.com</a> ) להפקת וידאו. עבודה זו מומנה על ידי מענקים (R03DC010065-Parker; RO1DC007174-Edge; P30DC05209-Core MEEI תמיכה עבור שמיעה מחקר) מ NIDCD.

ביום 1. עיקור וציפוי של coverslips זכוכית. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יבש לעקר מיקרוסקופ coverslips זכוכית החיטוי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את coverslips מעוקרים לשתי בארות של מנה טרום מעוקרים ארבע היטב תרבית תאים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> המעיל coverslips עם 01:01 poly-L-ornithine ו laminin בתוספת סרום 20% שור עוברית (FBS) לילה ב 4 ° C. <ol class="lalpha" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 400 μL poly-L-ornithine (פתרון 0.01% המאוחסן ב 4 ° C) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 400 laminin μL (50 מיקרוגרם / מ&quot;ל ​​מניות פתרון מאוחסנים aliquots ב -20 ° C) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 200 FBS μL (מאוחסן aliquots ב -20 ° C) </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חום לעקר את הכלים לנתיחה לילה 150 ° C חממה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בצע בינוני תרבות סרום המכיל 10% ו 10 מ&quot;ג / מ&quot;ל ​​אמפיצילין. <ol class="lalpha" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 90 מ&quot;ל של Dulbecco השתנה הנשר בינוני </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 5 מ&quot;ל FBS (מאוחסן aliquots ב -20 ° C) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 5 מ&quot;ל סוס בסרום (מאוחסן aliquots ב -20 ° C) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 10 אמפיצילין μL (10 מ&quot;ג / מ&quot;ל פתרון מניות מאוחסנים 4 ° C) </li></ol></li></ol> יום 2. בידוד של האיבר של קורטי. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לעקר את מכסה המנוע לנתיחה תזרים חיובי. <ol class="lalpha" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להדליק את האור UV במשך 20 דקות </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לרסס את כל המשטחים עם 70% אתנול ו לחכות 5 דקות לפני השימוש. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לערוף עכבר גור (P4) בבסיס מגנום foramen באמצעות מספריים ההפעלה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בקצרה לשטוף את הראש בצלחת 10 ס&quot;מ המכיל 70% אתנול. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את האפידרמיס בעזרת להב סכין המנתחים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פתח את הגולגולת לאורך תפר sagittal באמצעות להב סכין המנתחים ואז לחצות forebrain. לשמור על forebrain הזנב לניתוח נוסף. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את, forebrain המוח הקטן ואת גזע המוח באמצעות דיסקציה קהה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מוציאים את העצמות הטמפורלית (תאנה 2A), לטבול אותם בקצרה אתנול 70%, ולהעבירם צלחת 3 מ&quot;מ המכיל HBSS סטרילית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעזרת מלקחיים, להסיר את הבולה ואת הרקמה שמסביב מפרשת petrous של העצם הטמפורלית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אתר את שבלול בצורת קונכייה (תאנה 2B) ולהפריד אותו מן המערכת הוסטיבולרית באמצעות מלקחיים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בשלב זה של פיתוח, מבוך גרמי לא מסויד לחלוטין והוא גזור בקלות באמצעות מלקחיים. הסר את המבוך הגרמי של שבלול על ידי הפרדה זהירה החל בסוף הבסיס ומרגש apically באמצעות מלקחיים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> רצועה הספירלה ואת איבר צמוד של קורטי הוא מפותל לאורך הספירלה של כישור (איור 2C). הסר בזהירות את האיבר של קורטי על ידי הבטחת רצועה ספירלה בשעה האזור וו הבסיס באמצעות מלקחיים ההתרה זה כאשר אתה מזיז apically. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> החל בבסיס, להסיר את הרצועה ספירלה מן האיבר של קורטי באמצעות מלקחיים # 55 דק (איור 2 ד). Micro-הבידוד של האיבר של האפיתל קורטי חושית (אופציונאלי). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את האיבר האזור וו קורטי הבסיס באמצעות שני מזרקים אינסולין ½ סמ&quot;ק עם U-100 28G מצורף לצמיתות ½ מחטים כמו מלקחיים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> החל בפסגת, להסיר את הספירלה לימבוס משורה של תאים שיער הפנימי והמשך basally (תאנה 2E-F). ציפוי האיבר של קורטי explant </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את הפתרון poly-L-ornithine/laminin/FBS מבארות תרבות ולהוסיף 130 μl של המדיום לתרבות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העברת האיבר של קורטי גזור כדי coverslip הזכוכית מצופה בתרבות היטב המזרח explant כך cilia של תאים שיער מכוונים למעלה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את המדיום בתרבות גם באמצעות פיפטה 200 μL. ודא כי קרום basilar יוצר מגע עם מוצק coverslip הזכוכית מצופה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בזהירות להוסיף 130 μL של המדיום תרבות לאיבר של קורטי בעזרת פיפטה 200 מ&quot;ל. החלת שתי טיפות על פני השטח של האיבר של קורטי ואז לאט לאט להוסיף את נפח הנותרים לצד coverslip. ודא כי האיבר של קורטי לא לצוף בתקשורת תרבות, אבל עדיין מודבקת coverslip. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה לילה בשעה 37 ° C בנוכחות CO 5% 2. </li></ol> יום 3. Electroporation של הגן כתב לתוך איבר תרבותי של קורטי. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את המדיום תרבות מאיבר של התרבות קורטי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוספת 130 μL H 2 O דקות 1 ולאחר מכן להסיר בעזרת פיפטה 200 μL. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 30 μL של הכתב DsRed פלסמיד (2mg / מ&quot;ל H 2 O המאוחסן ב -20 ° C). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מראש את האלקטרודות של electroporator באמצעות micromanipulator כך האנודהקטודה nd הם משני צדי התרבות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צור דופק (27V, 30 מילישניות משך, 10 רכבות הדופק) כדי electroporate הגן כתב לתוך איבר התרבות explant קורטי. <ol class="lalpha" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אופציונלי: להפוך את הקוטביות של הדופק כדי להבטיח electroporation של transgene על modiolar וגם רצועה ספירלית צידי explant. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> המתן 5 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוספת 130 μL של Fugene 6: פתרון ה-DNA (3 חלקים Fugene ל-DNA חלקי 2). פתרון זה אמור להיות מוכן לפני תחילת ההליך electroporation (שלב 20) באמצעות 3 התחתונה מ&quot;ל עגול פוליסטירן המבחנה במנדף זרימה למינרית. כדי להפוך את הפתרון הזה: <ol class="lalpha" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 2.4 μL של Opti-ממ (המאוחסן ב 4 ° C) על המבחנה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 0.6 μL של מגיב 6 Fugene (המאוחסן ב 4 ° C) על המבחנה. הקפד להוסיף את Fugene ישירות Opti-ממ ולהימנע ממגע ישיר עם צדדים של המבחנה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> וורטקס לרגע 1. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה 5 דקות בטמפרטורת החדר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 2.0 μL כתב DsRed פלסמיד DNA גדילי כפול (המאוחסן ב -20 ° C ב-DNA 100 מיקרוגרם / מ&quot;ל H 2 aliquots O). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> וורטקס לרגע 1. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה 15 דקות בטמפרטורת החדר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוספת 200 μL של המדיום לתרבות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> וורטקס לרגע 1. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה לילה בשעה 37 ° C ב 5% CO 2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 2 מ&quot;ל בינוני תרבות לתרבות היטב דגירה של 37 מעלות צלזיוס למשך עד 10 ימים. </li></ol> נציג תוצאות אנו מציגים שיטה הבידוד של האיבר של קורטי מ - עכבר הלידה. ההליך יכול לשמש עכברים צעיר כמו יום עובריים 16 עד יום הלידה על 6, ובנקודה המבוך הגרמי הופך מסויד מספיק כדי להבהיר לנתיחה מסורבלת. לאחר האיבר של קורטי הוא גזור, זה עשוי להיות מצופה תרבותי או בשלמותה (איור 3) או אפיתל מיקרו מבודד חושית (איור 4). הצגנו עוד טכניקה כדי להביע את הגנים אקסוגניים באיבר תרבותי של קורטי. תרבות organotypic שימושית עבור סוגים רבים אחרים של מחקר, כגון ניתוח של איבר קורטי של ביטוי גנים באמצעות RT-PCR או הכלאה באתרו, איבר קורטי שיתוף התרבות תאים עם הגנגליון ספירלה או בתאי גזע ממקור חיצוני באמצעות מיקרו לבודד 3, או בניתוח חוץ גופית מוות שיער תא והתחדשות. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/1685/1685fig1.jpg"><img src="/files/ftp_upload/1685/1685fig1tmb.jpg" alt="איור 1" border="0" /></a> באיור 1. הצלב סעיף של האיבר P4 Murine של קורטי. (א) חתך מ להפוך את הבסיס של שבלול cryosectioned המתקבל עכבר P4 ממחיש את מבנה כללי של שבלול Murine המתואר בפרוטוקול זה. התקשורת scala גובל רצועה הלולייניות stria vascularis רוחבית, הממברנה של Reissner superiorly, לימבוס ספירלה מדיאלית, ואת קרום basilar inferiorly. תיבת הצביע על האזור התרחב ב (ב) איבר קורטי ממוקם בצד מעולה של קרום basilar וכולל שורה אחת של תאים השיער הפנימיים, שלוש שורות של תאים השיער החיצונית, והתאים שלהם התומכים. קו מקווקו 1 מציין את מיקומו לאורך הממברנה basilar כי יוסר במהלך איבר זה של דיסקציה קורטי. קו מקווקו 2 מציין את מיקומו לאורך הממברנה basilar כי יוסר במהלך ההליך מיקרו הבידוד. גרין מציין תיוג immunohistochemical של calbindin, אשר תוויות תאים interdental של לימבוס ספירלה, תאים שיער שבלול, הגנגליון נוירונים ספירלה, כמו גם תאים של הרצועה ספירלה stria vascularis 7. תיוג DAPI של גרעיני הוא בכחול. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/1685/1685fig2.jpg"><img src="/files/ftp_upload/1685/1685fig2tmb.jpg" alt="איור 2" border="0" /></a> איור 2. איברים של דיסקציה קורטי. תמונות מתוך וידאו המלווה של האיבר של קורטי להדגיש דיסקציה) של מערכת שיווי המשקל ואת השבלול הממוקם בתוך העצם הטמפורלית מבודדים (אדום), ב &#39;) את המבוך הגרמי של שבלול, ג) את הרצועה ספירלה מצורף האיבר של קורטי לאחר הסרת המבוך הגרמי, ד) הסרת רצועה הלולייניות stria vascularis (אדום) של האיבר של קורטי, E) מיקרו הבידוד של האפיתל חושית מן לימבוס ספירלה (אדום), ו-F) מבודדים ספירלה לימבוס (משמאל) אפיתל סנסורי (מימין). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/1685/1685fig3.jpg"><img src="/files/ftp_upload/1685/1685fig3tmb.jpg" alt="איור 3" border="0" /></a> איור 3. איבר תרבותי של קורטי explant. DIC התמונה מראה את איברקורטי של עכבר-P4 Atoh1 nGFP כי היה מבודד, מצופה, ותרבותי במשך חמישה ימים, כמתואר. עכבר זה כבר מהונדסים גנטית כך התאים המבטאים את הגן הפרו שיער תא homolog אטונלי 1 (aka Atoh1 Math1) התערוכה חלבון פלואורסצנטי ירוק כי הוא מקומי לגרעין 8. האיברים של קורטי מעכברים אלה תערוכה תווית ה-GFP גרעיני גרעיני כל תא שיער ולכן מאפשרים ראיה קל של האפיתל חושית באמצעות מיקרוסקופ epifluorescent. הספירלה לימבוס גדול יחסית ניתן לראות לרוחב האפיתל חושית. תאים mesenchymal אשר מקורם האיבר של קורטי היגרו מן explant. התווית גרעיני כחול הוא DAPI. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/1685/1685fig4.jpg"><img src="/files/ftp_upload/1685/1685fig4tmb.jpg" alt="איור 4" border="0" /></a> איור 4. Micro-מבודדים אפיתל תחושתי. תמונה Epifluorescent המתקבל האפיתל חושית כי כבר מבודד איבר P4 Murine של קורטי כמתואר ותרבותיים בין לילה. מיקרו לבודד נקבע אז paraformaldehyde 4% ומעובד immunolabeling 7 א שרירן אשר תוויות בתאי השיער בשבלול. הערה העדר הספירלה לימבוס יחסית גדול מן הדמות 3. התווית גרעיני כחול הוא DAPI. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/1685/1685fig5.jpg"><img src="/files/ftp_upload/1685/1685fig5tmb.jpg" alt="איור 5" border="0" /></a> איור 5. Electroporation של הגן כתב DsRed לתוך איבר תרבותי של קורטי. איברים שלמים של קורטי מן הגורים P4 Atoh1-nGFP עכבר בודדו, מצופה, ו electroporated אז עם הגן כתב DsRed כמתואר ואחר כך מתחת למיקרוסקופ epifluorescent. תאים של האיבר של קורטי explant כי הביע את חלבון מהונדס כתב DsRed התערוכה תאים פלואורסצנטי אנדוגני אדום התערוכה אפיתל סנסורי פלואורסצנטי ירוק גרעיני. התאים הטרנסגניים ניתן לראות ברחבי לימבוס ספירלה אפיתל תחושתי.

<ol>
	<li>Sobkowicz, H. M., Bereman, B., Rose, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organotypic+Development+of+the+Organ+of+Corti+in+Culture.">Organotypic Development of the Organ of Corti in Culture.</a> Journal of Neurocytology. 119 (4), 543-543 (1975).</li><li>Zheng, J. L., Gao, W. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Overexpression+of+Math1+induces+robust+production+of+extra+hair+cells+in+postnatal+rat+inner+ears.">Overexpression of Math1 induces robust production of extra hair cells in postnatal rat inner ears.</a> Nature Neuroscience. 3 (6), 580-580 (2000).</li><li>Martinez-Monedero, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=THE+POTENTIAL+ROLE+OF+ENDOGENOUS+STEM+CELLS+IN+REGENERATION+OF+THE+INNER+EAR.">THE POTENTIAL ROLE OF ENDOGENOUS STEM CELLS IN REGENERATION OF THE INNER EAR.</a> J Neurobiol. 66 (4), 319-319 (2006).</li><li>Saffer, L. D., Gu, R., Corwin, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+RT-PCR+analysis+of+mRNA+for+growth+factor+receptors+in+damaged+and+control+sensory+epithelia+of+rat+utricles.">An RT-PCR analysis of mRNA for growth factor receptors in damaged and control sensory epithelia of rat utricles.</a> Hearing Research. 94 (1,2), 14-14 (1996).</li><li>Zhang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation,+growth+and+differentiation+of+hair+cell+progenitors+from+the+newborn+rat+cochlear+greater+epithelial+ridge.">Isolation, growth and differentiation of hair cell progenitors from the newborn rat cochlear greater epithelial ridge.</a> Journal of Neuroscience Methods. 164 (2), 271-271 (2007).</li><li>Jones, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibitors+of+Differentiation+and+DNA+Binding+(Ids)+Regulate+Math1+and+Hair+Cell+Formation+during+the+Development+of+the+Organ+of+Corti.">Inhibitors of Differentiation and DNA Binding (Ids) Regulate Math1 and Hair Cell Formation during the Development of the Organ of Corti.</a> J. Neurosci. 26 (2), 550-550 (2006).</li><li>Daniela, B., Josef, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calbindin+and+S100+protein+expression+in+the+developing+inner+ear+in+mice.">Calbindin and S100 protein expression in the developing inner ear in mice.</a> The Journal of Comparative Neurology. 513 (5), 469-469 (2009).</li><li>Helms, A. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autoregulation+and+multiple+enhancers+control+Math1+expression+in+the+developing+nervous+system.">Autoregulation and multiple enhancers control Math1 expression in the developing nervous system.</a> Development. 127 (6), 1185-1185 (2000).</li><li>Zheng, J. L., Wei-Qiang, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+Damage+to+Auditory+Neurons+and+Hair+Cells+by+Ototoxins+and+Neuroprotection+by+Specific+Neurotrophins+in+Rat+Cochlear+Organotypic+Cultures.">Differential Damage to Auditory Neurons and Hair Cells by Ototoxins and Neuroprotection by Specific Neurotrophins in Rat Cochlear Organotypic Cultures.</a> European Journal of Neuroscience. 8 (9), 1897-1897 (1996).</li></ol>

ישנם כמה פרטים כי הם קריטיים להצלחת הליך זה. ככל שהזמן מהבידוד העצם הטמפורלית לאיבר של קורטי הדגירה, כך גובר הסיכוי כי האיברים יצרף coverslip והתוצאה בתרבויות איבר קיימא. לכן, חשוב להגביל את כמות הזמן בין לנתיחה ומיקום האיברים בחממה. הבחירה של אנטיביוטיקה היא קריטית גם, שכן אנטיביוטיקה aminoglycoside רבים ototoxic תגרום מוות של תאים שיער. אמנם עדיף לוותר על השימוש באנטיביוטיקה לגמרי, זה משאיר פתוחה את האפשרות של זיהום. לכן, אנו ממליצים על שימוש 10 מיקרוגרם / מ&quot;ל ​​אמפיצילין ככלל להתגבר על בעיות זיהום פוטנציאליים. ההיבט המטריד ביותר של זה, הליכים אחרים לתרבות העיקרי של האיבר של קורטי, הוא הנטייה של איברים כדי לצוף מעל צלחות במהלך הדגירה. למרות תרבויות איבר צף יכול להישאר קיימא עבור 5-7 ימים, יש חסרונות של איברים culturing צף. למשל, בתרבויות איבר צף להתקפל לעתים קרובות על עצמם לאחר 4-5 ימים טיוח מיקרוסקופיה בעייתי. לאחר מכן, שלמות מבנית של איבר יכול להיות בסכנה בהשוואה לאיברים כי כבר מודבקת coverslip. מצאנו כי בטכניקות הבאות לעזור להבטיח כי האיבר של קורטי לא לצוף בתקשורת תרבות, אבל עדיין מודבקת coverslip. ראשית, זכוכית מעיל coverslips ב 01:01 polyornithine / laminin בתוספת 20% FBS כמתואר. הדגירה לילה קרא בפרוטוקול זה הזמן המינימלי כי הצלחת צריך להיות מצופה. במעבדה שלנו, אנחנו לעתים קרובות מעיל את כל הצלחות שאנו זקוקים למשך שבוע ולשמור אותם על 4 מעלות צלזיוס עד יום לפני השימוש, כאשר אנו להעביר אותם בחממה במשך הדגירה לילה. שנית, לאחר האיברים מועברים coverslips מצופה, המזרח explant כך cilia של תאים שיער הפנים כלפי מעלה. אוריינטציה זו תקל על דבקות של קרום basilar לצלחת התרבות. שלישית, להסיר את התקשורת בתוך הבאר לצרף explant אל צלחת מצופה. פעולה זו תבטיח קשר בין המנה תרבות הממברנה basilar ולשפר את היכולת של explants לדבוק הזכוכית. זה יהיה גם לסייע בשמירה על שלמות מבנית של שורות תאים שיער. לבסוף, בזהירות לטפטף 2 טיפות בינוני תרבות על פני השטח של האיבר של קורטי בעזרת פיפטה 200 קיבולת μL ואז לאט לאט למלא היטב על ידי טפטוף נפח הנותרים (של μL 130 סה&quot;כ) בצד של coverslip. חשוב לעבוד במהירות כדי להבטיח את הקובץ המצורף של האיבר של קורטי אל coverslip המצופה. מ חניכה של לנתיחה כדי הדגירה של explants, זה בדרך כלל לוקח 10 דקות עבור המפעיל מיומנת כדי להשלים את האיבר של ההליך בידוד קורטי. בפרוטוקול זה, אנו גם מציגים שיטה לבידוד מיקרו של האפיתל חושית מן לימבוס ספירלה של האיבר של קורטי. בהליך זה, לימבוס הספירלה הוא גזור מן האפיתל חושית באמצעות 28G ½ מחטים אינסולין ככלים לנתיחה. כתוצאה מכך מיקרו לבודד מורכב שורות של תאים השיער ואת התאים המתאימים תמיכה (איור 3). אפיתל סנסורי מבודד אז יכול להיות מתורבת, כמתואר בפרוטוקול זה. הליך זה מיקרו הבידוד צריך להיות לעומת ההפרדה האנזימטית של epithelia החושי מן הרקמה הסובבת 4. אצל יונקים, כמו גם מינים שאינם יונקים כגון תרנגולות, עיכול thermolysin שיווי המשקל של האיברים תוצאות מבודדים בבידוד של epithelia חושית מתאי מרתף mesenchymal 4. ב עכברוש שבלול, התוצאות thermolysin העיכול בהפרדה הרכס אפיתל יותר, רכס אפיתל פחותים epithelia חושית מלווה מן הקרום המרתף 5. עם זאת, לא ברור אם אפיתל סנסורי שבלול יכול לצרף את הצלחות בלי מצופים בתאים mesenchymal הנלווים. בעוד הן את שיטת בידוד מכני מיקרו עיכול אנזימטי שיטה לגרום להפרדת epithelia החושי מן לימבוס ספירלה, היתרונות של דיסקציה מיקרו לבודד את פני העיכול thermolysin לכלול בפרוטוקול קצר יחסית, ריאגנטים זול, מתח פוטנציאלי פחות explant בשל ההשפעות האנזימטית של העיכול. בנוסף, קרום המרתף נותר ללא שינוי בגישה זו, אשר עשוי לשפר את הקשר של האפיתל חושית הצלחת תרבות. החסרונות של שיטה זו כוללים את הצורך לפתח את הכישורים לנתיחה זה עדין נזק מכני פוטנציאל האפיתל חושית הנובע דיסקציה מיקרו. כדוגמה השירות של הליך זה, אנו גם מציגים דוגמה אחת לשימוש של איבר שלקורטי תרבויות; electroporation של גנים ממקור חיצוני לתוך התרבות explant. ההליך electroporation שתוארו לעיל מבוסס על שיטות קודמות של איבר electroporation קורטי. יש לציין, נג ו גאו (2000) לתאר את electroporation של איברים עכברוש מבודד של קורטי שבו explants מוחזקים מקום electroporation ידי חריץ יצוק של agarose ו מצופה מכן על קולגן שקופיות מצופה 8-LabTek היטב במדיום סרום ללא 2. היתרון של הגישה שלהם היא כי האיברים מכוונים כך משטחים העליון של explants פני הקתודה, אשר אמור תיאורטית לגרום הפצה גם של תאים electroporated ברחבי explant. בידיים שלנו לעומת זאת, השיטה שאנחנו מתארים שיפור על הליך זה, כי האיבר של קורטי נשאר מודבקת coverslip לאורך ההליך ובכך להפחית את המניפולציה של explant לאחר electroporation. בנוסף, אחוז גבוה יותר של איברים של קורטי נשאר קשור coverslips בשיטה זו המוצגים. השיטה שלנו נלקח ג&#39;ונס, et al. (2006) אשר משתמשת תוספת של מגיב 6 Fugene כדי להגביר את היעילות של ביטוי גנים לאחר electroporation. בפרוטוקול Jones et al. (2006), איברים הם electroporated, מודגרות במשך 5 דקות עם 100 μL של מגיב 6 transfection Fugene, ו 6 מצופה. השיטה שלנו שונה בשימוש יחס 3:02 של מגיב 6 Fugene ל-DNA פלסמיד, אשר מצאנו אמפירית לתת ביטוי מהונדס אופטימלי עם רעילות איבר מינימלי. אנחנו לא משתמשים חי Fugene מגיב 6, אשר עלולה לגרום לרעילות של תרבויות. תצורת אלקטרודה בפרוטוקול שלנו, כמו גם ג&#39;ונס et al. (2006), התוצאה היא ביטוי גנים העיקרי או הספירלה או לימבוס אפיתל סנסורי תלוי בעמדה של הקתודה. אמנם ישנם תאים חיובי DsRed בצד הרחוק של התרבות לקתודה, יש ריכוז גבוה של תאים מהונדס קרוב הקתודה. כדי להבטיח ביטוי מלא של transgene בשני צידי האיבר של קורטי explant, הזרם יכול להיות הפוך לרכבת הדופק השני על ידי היפוך פשוט מוביל. פרוטוקול התוצאות המוצגות ביטוי חזק של transgene לאורך האיבר של קורטי (איור 5).

<table border="1">
	<thead>
		<tr>
			<th>Material Name</th>
			<th>Type</th>
			<th>Company</th>
			<th>Catalogue Number</th>
			<th>Comment</th>
		</tr>
	</thead>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Glass microscope coverslips</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>DYNALAB Corporation (Rochester, NY)</td>
			<td>2010</td>
			<td>10mm diameter, circle #1, 1mm thickness, 1 ounce</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4 ringed cell culture dish</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>Greiner Bio-One (Frickenhausen, Germany)</td>
			<td>627170</td>
			<td>Sterilized 35 X 10 mm cell culture dish with 4 inner rings</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-L-ornithine</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>Sigma-Aldrich Company (St. Louis, MO)</td>
			<td>P4957</td>
			<td>0.01% Solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laminin</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>BD Biosciences (Franklin Lakes, NJ) </td>
			<td>354232</td>
			<td>made in mouse</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>Invitrogen (Carlsbad, CA)</td>
			<td>26140-095</td>
			<td>Qualified</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Operating scissors</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>Roboz Surgical Instrument Co. (Gaithersburg, MD)</td>
			<td>RS-6806</td>
			<td>Straight, sharp-blunt length 5"</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>#11 Scalpel Blade</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>Becton Dickenson (Franklin Lakes, NJ)</td>
			<td>372611</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>#4 Dumoxel forceps</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>Fine Science Tools (Foster City, CA)</td>
			<td>11241-30</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>#55 Dumostar fine forceps</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>Fine Science Tools (Foster City, CA)</td>
			<td>11295-51</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco's Modified Eagle Medium </td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>Invitrogen (Carlsbad, CA)</td>
			<td>10564-011</td>
			<td>High Glucose</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Horse Serum</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>Invitrogen (Carlsbad, CA)</td>
			<td>2605088</td>
			<td>Heat Inactivated</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ampicillin Sodium Salt </td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>Invitrogen (Carlsbad, CA)</td>
			<td>11593-027</td>
			<td>Irradiated</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&frac12; cc Lo-Dose Insulin Syringe </td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>Becton Dickenson (Franklin Lakes, NJ)</td>
			<td>329465</td>
			<td>U-100 28G&frac12;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fugene 6 Transfection Reagent</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>Roche (Mannheim, Germany)</td>
			<td>11-815-091-001</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polystyrene test tube</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>Fisher Scientific (Pittsburgh, PA)</td>
			<td>14-956-5A</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laminar flow hood</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>The Baker Company (Stanford, ME)</td>
			<td>Model SG603a</td>
			<td>SterileGARD III 
				Advanced Class II 
				Biological Safety Cabinet</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Opti-MEM I Reduced-Serum Medium</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>Invitrogen (Carlsbad, CA)</td>
			<td>31985</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reporter plasmid</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>Clontech (Mountain View, CA)</td>
			<td>632539</td>
			<td>pCMV DsRed-Express 2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electroporator</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>BioRad (Hercules, CA)</td>
			<td>165&#x2013;2662</td>
			<td>BioRad Gene Pulser Xcell</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

primary culture and plasmid electroporation of the murine organ of corti. 

ב כל היונקים, אפיתל סנסורי לאודישן ממוקם לאורך האיבר של קורטי מתפתלת השוכן בתוך שבלול בצורת קונכייה של האוזן הפנימית (איור 1). תאים שיער של שבלול פיתוח, שהם תאים mechanosensory של מערכת השמיעה, מיושרים בשורה אחת של תאים שיער הפנימי שלושה (בבסיס לאמצע פונה) עד ארבעה (בתורו apical) שורות של תאים השיער החיצונית כי תוחלת אורך האיבר של קורטי. תאים שיער transduce קול-Induced תנודות מכניות של הממברנה basilar לאימפולסים עצביים שהמוח יכול לפרש. רוב המקרים של אובדן שמיעה sensorineural נגרמים מוות או תפקוד לקוי של תאים שיער שבלול. כלי חיוני יותר ויותר מחקרים שמיעתי הוא בידוד בתרבות במבחנה של explant האיבר 1,2,9. מבודדים פעם, explants עלול להיות מנוצל במספר דרכים על מנת לספק מידע בנוגע נורמטיבית, חריג, או הפיזיולוגיה טיפולית. התבטאות גנים, תנועתיות stereocilia, התא ביולוגיה מולקולרית, וכן גישות הביולוגי התחדשות התאים השיער הם דוגמאות של יישומים ניסיוני של איבר explants קורטי. פרוטוקול זה מתאר שיטה לבידוד והתרבות של האיבר של קורטי מעכברים הילוד. הווידאו הנלווה כולל כיוונים בשלבים עבור בידוד של העצם הטמפורלית מן הגורים העכבר, ובידוד הבאות של שבלול, רצועה ספירלית, ועל איבר קורטי. מבודדים פעם, האפיתל חושית יכול להיות מצופה תרבותי במבחנה בשלמותו, או כמו גזור נוספת מיקרו לבודד כי חסרה את הספירלה לימבוס ונוירונים ספירלה גנגליון. באמצעות שיטה זו, explants העיקרי יכול להישמר במשך 7-10 ימים. כדוגמה השירות של הליך זה, האיבר של קורטי explants יהיה electroporated עם הגן כתב אקסוגניים DsRed. שיטה זו מספקת שיפור פני שיטות אחרות שפורסמו משום שהוא מספק כיוונים לשחזור, חד משמעי, ועל בשלבים עבור הבידוד, microdissection, התרבות העיקרית של האיבר של קורטי.

Watch this Scientific Journal Video about Primary Culture and Plasmid Electroporation of the Murine Organ of Corti. at JoVE.com

Primary Culture and Plasmid Electroporation of the Murine Organ of Corti.

הליך זה מתאר שיטה לבידוד והתרבות של האיבר של קורטי Murine עם או בלי לימבוס ספירלה ספירלה נוירונים גנגליון. אנחנו גם להדגים שיטה הביטוי של הגן כתב אקסוגניים האיבר של קורטי explant ידי electroporation.

תרבות ראשיים electroporation פלסמיד של האיבר Murine של קורטי.

In all mammals, the sensory epithelium for audition is located along the spiraling organ of Corti that resides within the conch shaped cochlea of the ...

Research

JoVE Journal

Biology

Primary Culture and Plasmid Electroporation of the Murine Organ of Corti. 

Electroporation of Mycobacteria

Electroporation של mycobacteria

High efficiency transformation is a major limitation in the study of mycobacteria. The genus Mycobacterium can be difficult to transform; this is mainly ...

The Preparation of Primary Hematopoietic Cell Cultures From Murine Bone Marrow for Electroporation

הכנת ראשי בתרביות תאים hematopoietic ממח העצם Murine עבור electroporation

It is becoming increasingly apparent that electroporation is the most effective way to introduce plasmid DNA or siRNA into primary cells. The Gene Pulser ...

Primary Culture of Adult Rat Heart Myocytes

תרבות ראשונית של הלב Myocytes למבוגרים עכברוש

Cultured primary adult rodent heart cells are an important model system for cardiovascular research.  Nevertheless, establishment of robust, viable ...

Isolation and Primary Culture of Rat Hepatic Cells

בידוד תרבות ראשונית של תאים בכבד עכברוש

Primary hepatocyte culture is a valuable tool that has been extensively used in basic research of liver function, disease, pathophysiology, pharmacology ...

Isolation and Culture of Mouse Primary Pancreatic Acinar Cells

בידוד והתרבות של תאי לבלב הראשיים acinar עכבר

This protocol permits rapid isolation (in less than 1 hr) of murine pancreatic acini, making it possible to maintain them in culture for more than one ...

Isolation and Primary Culture of Mouse Aortic Endothelial Cells

בידוד והתרבות ראשית של לתאי אנדותל עכבר אב העורקים

The vascular endothelium is essential to normal vascular homeostasis. Its dysfunction participates in various cardiovascular disorders. The mouse is an ...

Fat Body Organ Culture System in Aedes Aegypti, a Vector of Zika Virus

Fat Body Organ Culture System in Aedes Aegypti, a Vector of Zika Virus

תרבות הגוף השמן איברים במערכת Aedes Aegypti, וקטור של וירוס Zika

The insect fat body plays a central role in insect metabolism and nutrient storage, mirroring functions of the liver and fat tissue in vertebrates. Insect ...

Novel Method of Plasmid DNA Delivery to Mouse Bladder Urothelium by Electroporation

הרומן שיטת המסירה דנ א פלסמיד העכבר Urothelium שלפוחית השתן על ידי אלקטרופורציה

Genetically engineered mouse models (GEMMs) are extremely valuable in revealing novel biological insights into the initiation and progression mechanisms ...

Primary Culture of Rat Adrenocortical Cells and Assays of Steroidogenic Functions

תרבות העיקרי של תאים Adrenocortical חולדה, מבחני של פונקציות שחלת בקר

The hormone which the adrenal cortex secretes is vital for animals against stress and diseases. The method described here is the procedure of primary ...

Isolation and Culture of Primary Aortic Endothelial Cells from Miniature Pigs

בידוד ותרבות של בתאי אבי העורקים הראשוניים מחזירים זעירים

Xenotransplantation is a promising way to resolve the shortage of human organs for patients with end-stage organ failure, and the pig is considered as a ...