Name: direct observation of enzymes replicating dna using a single-molecule dna stretching assay
Uploaded: 2010-03-23T17:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Direct Observation of Enzymes Replicating DNA Using a Single-molecule DNA Stretching Assay at JoVE.com

O desenvolvimento do DNA que se estende do ensaio foi auxiliado por Paulo Blainey, Lee Jong-Bong, e Hamdan Samir. Este trabalho é apoiado pelos Institutos Nacionais de Saúde concede a Charles Richardson (GM54397), e Antoine van Oijen (GM077248).

1. Modelo de replicação do DNA DNA para a reação é um DNA λ linearizada modificado por anelamento de oligonucleotídeos para formar uma forquilha de replicação. Além disso, biotina é anexado ao final de uma vertente do DNA λ, e uma porção digoxigenina está ligado à outra extremidade do fio mesmo 1. Materiais: Bacteriófago λ DNA, Oligonucleotídeos: braço garfo biotinilado (A: 5&#39;-biotina-AAAAAAAAAAAAAAAAGAGTACTGTACGA...

<ol>
	<li>Lee, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+primase+acts+as+a+molecular+brake+in+DNA+replication.">DNA primase acts as a molecular brake in DNA replication.</a> Nature. 439, 621-624 (2006).</li><li>Tanner, N. A., van Oijen, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-molecule+observation+of+prokaryotic+DNA+replication.">Single-molecule observation of prokaryotic DNA replication.</a> Methods Mol Biol. 521, 397-410 (2009).</li><li>Sofia, S. J., Premnath, V. V., Merrill, E. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Poly(ethylene+oxide)+Grafted+to+Silicon+Surfaces:+Grafting+Density+and+Protein+Adsorption.">Poly(ethylene oxide) Grafted to Silicon Surfaces: Grafting Density and Protein Adsorption.</a> Macromolecules. 31, 5059-5070 (1998).</li><li>Tanner, N. A., Loparo, J. J., van Oijen, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualizing+single-molecule+DNA+replication+with+fluorescence+microscopy.">Visualizing single-molecule DNA replication with fluorescence microscopy.</a> J Vis Exp. , (2009).</li><li>Hamdan, S. M., Loparo, J. J., Takahashi, M., Richardson, C. C., van Oijen, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamics+of+DNA+replication+loops+reveal+temporal+control+of+lagging-strand+synthesis.">Dynamics of DNA replication loops reveal temporal control of lagging-strand synthesis.</a> Nature. 457, 336-339 (2009).</li><li>van Oijen, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-molecule+kinetics+of+lambda+exonuclease+reveal+base+dependence+and+dynamic+disorder.">Single-molecule kinetics of lambda exonuclease reveal base dependence and dynamic disorder.</a> Science. 301, 1235-1238 (2003).</li></ol>

É importante assegurar que a força de arrasto exercida sobre contas pelo fluxo laminar não influencia atividades enzimáticas das proteínas de replicação. Por exemplo, uma força de 3 pN que corresponde a uma vazão de 0,012 ml / min não afetam a replicação do filamento de DNA de liderança. Isto, contudo, afetar as atividades enzimáticas que ocorrem durante a síntese de DNA coordenada, e, portanto, tem que ser reduzida para 1,5 pN. A força de arrasto pode ser facilmente controlado, alterando a taxa de fluxo...

<!DOCTYPE html PUBLIC "-//W3C//DTD XHTML 1.0 Transitional//EN" "http://www.w3.org/TR/xhtml1/DTD/xhtml1-transitional.dtd">
<html xmlns="http://www.w3.org/1999/xhtml" xml:lang="en" lang="en">	
		
		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>Bacteriophage &lambda; DNA</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>New England Biolabs</td>
<td>N3011L</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>DNA Oligonucleotides</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Integrated DNA Technologies</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>T4 DNA Ligase</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>New England Biolabs</td>
<td>M0202L</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>T4 Polynucleotide Kinase</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>New England Biolabs</td>
<td>M0201L</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>&alpha;-digoxigenin Fab</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Roche</td>
<td>11214667001</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Tosyl Activated Beads</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Dynal/Invitrogen</td>
<td>142-03</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Magnetic Separator</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>Dynal MPC</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>3-aminopropyl-triethoxysilane</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>A3648</td>
<td>Other aminosilanes can be used or mixed with non-amine reactive silanes for sparser surfaces</td>
</tr>
<tr>
<td>Succinimidyl propionate PEG</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Nektar</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Similar PEGs can be purchased from Nanocs, CreativePEGWorks, etc.</td>
</tr>
<tr>
<td>Biotin-PEG-NHS</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Nektar</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Similar PEGs can be purchased from Nanocs, CreativePEGWorks, etc.</td>
</tr>
<tr>
<td>Double-sided tape</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Grace BioLabs</td>
<td>SA-S-1L</td>
<td>100 &mu;m thickness</td>
</tr>
<tr>
<td>Quartz slide</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Technical Glass</td>
<td>20 mm (W)x 50 mm (L)x 1mm (H)</td>
<td>Size to fit on coverslips. Drill holes with diamond-tip drill bits (DiamondBurs.net)</td>
</tr>
<tr>
<td>Polyethylene tubing</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Becton Dickinson</td>
<td>427416</td>
<td>0.76 mm ID, 1.22 OD 
Other size tubing can be substituted.</td>
</tr>
<tr>
<td>Streptavidin</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>S4762</td>
<td>Make 1 mg/mL solution, 25 &mu;L aliquots in PBS pH 7.3</td>
</tr>
<tr>
<td>Deoxyribonucleotide triphosphate solution mix</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>New England Biolabs</td>
<td>N0447</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Inverted Optical Microscope with 10X Objective</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Olympus</td>
<td>Olympus IX-51</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Permament rare-earth magnet</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>National Imports</td>
<td>www.rare-earth-magnets.com</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>CCD Camera</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>QImaging</td>
<td>Rolera-XR Fast 139</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Syringe Pump</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Harvard Apparatus</td>
<td>11 Plus</td>
<td>Operate in refill mode to facilitate solution changes</td>
</tr>
<tr>
<td>Fiber Illuminator</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Thorlabs Inc.</td>
<td>OSL1</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

direct observation of enzymes replicating dna using a single-molecule dna stretching assay

Nós descrevemos um método para observar a replicação em tempo real de moléculas de DNA individual mediada por proteínas do sistema de replicação bacteriófago. Linearizada λ DNA é modificada para ter um biotina na extremidade de um fio, e uma porção digoxigenina na outra extremidade do fio mesmo. O fim biotinilado é anexado a uma lamela de vidro funcionalizadas eo fim digoxigeninated para uma pequena pérola. A montagem destas amarras DNA-pérola sobre a superfície de uma célula de fluxo permite um fluxo laminar para ser aplicado a exercer uma força de arrasto na esfera. Como resultado, o DNA é esticada próximo e paralelo à superfície da lamínula, a uma força que é determinado pela taxa de fluxo (Figura 1). O comprimento do DNA é medida através do monitoramento da posição do talão. Diferenças de comprimento entre o DNA de um único e double-stranded são utilizados para obter informações em tempo real sobre a atividade das proteínas de replicação na bifurcação. Medir a posição do talão permite a determinação precisa das taxas e processivities de DNA descontrair e polimerização (Figura 2).

Watch this Scientific Journal Video about Direct Observation of Enzymes Replicating DNA Using a Single-molecule DNA Stretching Assay at JoVE.com

Direct Observation of Enzymes Replicating DNA Using a Single-molecule DNA Stretching Assay

Nós descrevemos um método para observar a replicação em tempo real de moléculas de DNA individual mediada por proteínas do sistema de replicação bacteriófago.

A observação direta de Enzimas DNA Replicação Usando um DNA molécula única Alongamento Assay

We describe a method for observing real time replication of individual DNA molecules mediated by proteins of the bacteriophage replication system. ...

Research

JoVE Journal

Biology

Visualizing Single-molecule DNA Replication with Fluorescence Microscopy

Replicação de DNA visualizar Único molécula com microscopia de fluorescência

We describe a simple fluorescence microscopy-based real-time method for observing DNA replication at the single-molecule level. A circular, forked DNA ...

Biologia

DNA Stable-Isotope Probing (DNA-SIP)

DNA Stable-Isotope Probing DNA-SIP

DNA-Stable Isotope Probing (DNA-SIP)

DNA stable-isotope probing (DNA-SIP) is a powerful technique for identifying active microorganisms that assimilate particular carbon substrates and ...

Primer-Free Aptamer Selection Using A Random DNA Library

Primer-Free Seleção Aptamer usando uma biblioteca de DNA Aleatório

Aptamers are highly structured oligonucleotides (DNA or RNA) that can bind to targets with affinities comparable to antibodies 1. They are identified ...

Generation of RNA/DNA Hybrids in Genomic DNA by Transformation using RNA-containing Oligonucleotides

Geração de RNA / DNA híbrido em DNA genômico por transformação por meio de RNA contendo Oligonucleotídeos

Synthetic short nucleic acid polymers, oligonucleotides (oligos), are the most functional and widespread tools of molecular biology. Oligos can be ...

Preparation of DNA-crosslinked Polyacrylamide Hydrogels

Preparação de ADN de poliacrilamida reticulada-hidrogéis

Mechanobiology is an emerging scientific area that addresses the critical role of physical cues in directing cell morphology and function. For example, ...

Combining Single-molecule Manipulation and Imaging for the Study of Protein-DNA Interactions

Combinando uma única molécula de Manipulação e imagem para o estudo das interações proteína-DNA

The paper describes the combination of optical tweezers and single molecule fluorescence detection for the study of protein-DNA interaction. The method ...

Real-time Imaging of Single Engineered RNA Transcripts in Living Cells Using Ratiometric Bimolecular Beacons

Imagens em tempo real de uma única Engineered RNA transcritos em células vivas usando raciométrica Bimolecular Beacons

The growing realization that both the temporal and spatial regulation of gene expression can have important consequences on cell function has led to the ...

Studying DNA Looping by Single-Molecule FRET

Estudar DNA Looping por Single-Molecule FRET

Bending of double-stranded DNA (dsDNA) is associated with many important biological processes such as DNA-protein recognition and DNA packaging into ...

Reduced-gravity Environment Hardware Demonstrations of a Prototype Miniaturized Flow Cytometer and Companion Microfluidic Mixing Technology

De gravidade reduzida Manifestações ambiente de hardware de uma tecnologia de mistura de fluxo Cytometer e Companion microfluídicos Prototype Miniaturized

Until recently, astronaut blood samples were collected in-flight, transported to earth on the Space Shuttle, and analyzed in terrestrial laboratories. If ...

A Proteoliposome-Based Efflux Assay to Determine Single-molecule Properties of Cl- Channels and Transporters

A Proteoliposome-Based Efflux Assay to Determine Single-molecule Properties of Cl- Channels and Transporters

A proteolipossoma-Based Efluxo Ensaio para determinar as propriedades de uma única molécula de Cl<sup&gt; -</sup&gt; Canais e Transportadores

The last 15 years have been characterized by an explosion in the ability to overexpress and purify membrane proteins from prokaryotic organisms as well as ...