Name: direct observation of enzymes replicating dna using a single-molecule dna stretching assay
Uploaded: 2010-03-23T17:30:00
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El desarrollo del ADN se extiende ensayo fue ayudado por Paul Blainey, Bong Jong-Lee, y Samir Hamdan. Este trabajo es apoyado por los Institutos Nacionales de Salud subvenciones a Charles Richardson (GM54397), y Antoine van Oijen (GM077248).

1. Patrón de ADN de replicación ADN para la reacción es un ADN lineal λ modificado por hibridación de oligonucleótidos para formar un tenedor de replicación. Además, la biotina se adjunta al final de una cadena del ADN λ, y una fracción de digoxigenina se une al otro extremo de la misma línea 1. Materiales: bacteriófago λ ADN, oligonucleótidos: brazo tenedor biotinilado (A: 5&#39;-biotina-AAAAAAAAAAAAAAAAGAGTACTGTACGATCTAGC...

<ol>
	<li>Lee, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+primase+acts+as+a+molecular+brake+in+DNA+replication.">DNA primase acts as a molecular brake in DNA replication.</a> Nature. 439, 621-624 (2006).</li><li>Tanner, N. A., van Oijen, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-molecule+observation+of+prokaryotic+DNA+replication.">Single-molecule observation of prokaryotic DNA replication.</a> Methods Mol Biol. 521, 397-410 (2009).</li><li>Sofia, S. J., Premnath, V. V., Merrill, E. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Poly(ethylene+oxide)+Grafted+to+Silicon+Surfaces:+Grafting+Density+and+Protein+Adsorption.">Poly(ethylene oxide) Grafted to Silicon Surfaces: Grafting Density and Protein Adsorption.</a> Macromolecules. 31, 5059-5070 (1998).</li><li>Tanner, N. A., Loparo, J. J., van Oijen, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualizing+single-molecule+DNA+replication+with+fluorescence+microscopy.">Visualizing single-molecule DNA replication with fluorescence microscopy.</a> J Vis Exp. , (2009).</li><li>Hamdan, S. M., Loparo, J. J., Takahashi, M., Richardson, C. C., van Oijen, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamics+of+DNA+replication+loops+reveal+temporal+control+of+lagging-strand+synthesis.">Dynamics of DNA replication loops reveal temporal control of lagging-strand synthesis.</a> Nature. 457, 336-339 (2009).</li><li>van Oijen, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-molecule+kinetics+of+lambda+exonuclease+reveal+base+dependence+and+dynamic+disorder.">Single-molecule kinetics of lambda exonuclease reveal base dependence and dynamic disorder.</a> Science. 301, 1235-1238 (2003).</li></ol>

Es importante asegurarse de que la fuerza de arrastre ejercida sobre cuentas de flujo laminar no influye en la actividad enzimática de las proteínas de replicación. Por ejemplo, una fuerza de 3 PN que corresponde a un caudal de 0.012 ml / min no afectan a la replicación de la hebra de ADN líder. Sin embargo, sí afecta a las actividades enzimáticas que se producen durante la síntesis de ADN coordinado, y por lo tanto, tiene que reducirse a 1,5 pN. La fuerza de arrastre puede ser fácilmente controlado por el camb...

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		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>Bacteriophage &lambda; DNA</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>New England Biolabs</td>
<td>N3011L</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>DNA Oligonucleotides</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Integrated DNA Technologies</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>T4 DNA Ligase</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>New England Biolabs</td>
<td>M0202L</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>T4 Polynucleotide Kinase</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>New England Biolabs</td>
<td>M0201L</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>&alpha;-digoxigenin Fab</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Roche</td>
<td>11214667001</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Tosyl Activated Beads</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Dynal/Invitrogen</td>
<td>142-03</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Magnetic Separator</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>Dynal MPC</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>3-aminopropyl-triethoxysilane</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>A3648</td>
<td>Other aminosilanes can be used or mixed with non-amine reactive silanes for sparser surfaces</td>
</tr>
<tr>
<td>Succinimidyl propionate PEG</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Nektar</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Similar PEGs can be purchased from Nanocs, CreativePEGWorks, etc.</td>
</tr>
<tr>
<td>Biotin-PEG-NHS</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Nektar</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Similar PEGs can be purchased from Nanocs, CreativePEGWorks, etc.</td>
</tr>
<tr>
<td>Double-sided tape</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Grace BioLabs</td>
<td>SA-S-1L</td>
<td>100 &mu;m thickness</td>
</tr>
<tr>
<td>Quartz slide</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Technical Glass</td>
<td>20 mm (W)x 50 mm (L)x 1mm (H)</td>
<td>Size to fit on coverslips. Drill holes with diamond-tip drill bits (DiamondBurs.net)</td>
</tr>
<tr>
<td>Polyethylene tubing</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Becton Dickinson</td>
<td>427416</td>
<td>0.76 mm ID, 1.22 OD 
Other size tubing can be substituted.</td>
</tr>
<tr>
<td>Streptavidin</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>S4762</td>
<td>Make 1 mg/mL solution, 25 &mu;L aliquots in PBS pH 7.3</td>
</tr>
<tr>
<td>Deoxyribonucleotide triphosphate solution mix</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>New England Biolabs</td>
<td>N0447</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Inverted Optical Microscope with 10X Objective</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Olympus</td>
<td>Olympus IX-51</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Permament rare-earth magnet</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>National Imports</td>
<td>www.rare-earth-magnets.com</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>CCD Camera</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>QImaging</td>
<td>Rolera-XR Fast 139</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Syringe Pump</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Harvard Apparatus</td>
<td>11 Plus</td>
<td>Operate in refill mode to facilitate solution changes</td>
</tr>
<tr>
<td>Fiber Illuminator</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Thorlabs Inc.</td>
<td>OSL1</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

direct observation of enzymes replicating dna using a single-molecule dna stretching assay

Se describe un método para observar la replicación en tiempo real de las moléculas individuales de ADN mediada por proteínas del sistema de replicación del bacteriófago. Linealizado λ ADN se modifica para tener un biotina en el extremo de un hilo, y una fracción de digoxigenina en el otro extremo de la misma cadena. El final con biotina se une a un cubreobjetos funcionalizados y al final digoxigeninated a una pequeña cuenta. El montaje de estas correas de ADN derramará en la superficie de una célula de flujo permite un flujo laminar que se aplicarán para ejercer una fuerza de arrastre sobre el talón. Como resultado, el ADN se estira cerca y en paralelo a la superficie del cubreobjetos en una fuerza que está determinada por la velocidad de flujo (Figura 1). La longitud del ADN se mide mediante el control de la posición de la bola. Las diferencias de longitud entre el ADN de una sola y de doble cadena se utilizan para obtener información en tiempo real sobre la actividad de las proteínas de la replicación en el tenedor. Medición de la posición de la bola permite la determinación precisa de las tasas y processivities de anulación de ADN y la polimerización (Figura 2).

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Direct Observation of Enzymes Replicating DNA Using a Single-molecule DNA Stretching Assay

Se describe un método para observar la replicación en tiempo real de las moléculas individuales de ADN mediada por proteínas del sistema de replicación del bacteriófago.

La observación directa de ADN Enzimas Replicar El uso de un ADN de una sola molécula de estiramiento de ensayo

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