Name: direct observation of enzymes replicating dna using a single-molecule dna stretching assay
Uploaded: 2010-03-23T17:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Direct Observation of Enzymes Replicating DNA Using a Single-molecule DNA Stretching Assay at JoVE.com

Utvecklingen av DNA-stretching analysen fick hjälp av Paul Blainey, Jong-Bong Lee, och Samir Hamdan. Detta arbete stöds av National Institutes of Health bidrag till Karl Richardson (GM54397), och Antoine van Oijen (GM077248).

1. DNA-replikering Mall DNA för reaktionen är en linjär λ DNA modifieras av glödgning av oligonukleotider att bilda en replikering gaffel. Dessutom är biotin bifogas i slutet av en del av λ DNA, och en digoxigenin fraktion är ansluten till den andra änden av samma område 1. Material: bakteriofag λ DNA, oligonukleotider: biotinylerad gaffel armen (A: 5&#39;-biotin-AAAAAAAAAAAAAAAAGAGTACTGTACGATCTAGCATCAATCACAGGGTCAGGTTCGTTATTGT...

<ol>
	<li>Lee, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+primase+acts+as+a+molecular+brake+in+DNA+replication.">DNA primase acts as a molecular brake in DNA replication.</a> Nature. 439, 621-624 (2006).</li><li>Tanner, N. A., van Oijen, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-molecule+observation+of+prokaryotic+DNA+replication.">Single-molecule observation of prokaryotic DNA replication.</a> Methods Mol Biol. 521, 397-410 (2009).</li><li>Sofia, S. J., Premnath, V. V., Merrill, E. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Poly(ethylene+oxide)+Grafted+to+Silicon+Surfaces:+Grafting+Density+and+Protein+Adsorption.">Poly(ethylene oxide) Grafted to Silicon Surfaces: Grafting Density and Protein Adsorption.</a> Macromolecules. 31, 5059-5070 (1998).</li><li>Tanner, N. A., Loparo, J. J., van Oijen, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualizing+single-molecule+DNA+replication+with+fluorescence+microscopy.">Visualizing single-molecule DNA replication with fluorescence microscopy.</a> J Vis Exp. , (2009).</li><li>Hamdan, S. M., Loparo, J. J., Takahashi, M., Richardson, C. C., van Oijen, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamics+of+DNA+replication+loops+reveal+temporal+control+of+lagging-strand+synthesis.">Dynamics of DNA replication loops reveal temporal control of lagging-strand synthesis.</a> Nature. 457, 336-339 (2009).</li><li>van Oijen, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-molecule+kinetics+of+lambda+exonuclease+reveal+base+dependence+and+dynamic+disorder.">Single-molecule kinetics of lambda exonuclease reveal base dependence and dynamic disorder.</a> Science. 301, 1235-1238 (2003).</li></ol>

Det är viktigt att se till att dra kraft som verkar på pärlor med laminärt flöde inte påverkar enzymaktiviteten av replikering proteiner. Till exempel påverkar ett 3 pn-kraft som motsvarar ett flöde på 0,012 ml / min inte replikering av DNA ledande strängen. Det påverkar dock enzymatisk aktiviteter som äger rum under samordnad DNA-syntes, och det måste därför reduceras till 1,5 PN. Den dragkraft kan enkelt kontrolleras genom att ändra flödet eller en bredd av flödet kanal 5. <p class="jo...

<!DOCTYPE html PUBLIC "-//W3C//DTD XHTML 1.0 Transitional//EN" "http://www.w3.org/TR/xhtml1/DTD/xhtml1-transitional.dtd">
<html xmlns="http://www.w3.org/1999/xhtml" xml:lang="en" lang="en">	
		
		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>Bacteriophage &lambda; DNA</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>New England Biolabs</td>
<td>N3011L</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>DNA Oligonucleotides</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Integrated DNA Technologies</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>T4 DNA Ligase</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>New England Biolabs</td>
<td>M0202L</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>T4 Polynucleotide Kinase</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>New England Biolabs</td>
<td>M0201L</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>&alpha;-digoxigenin Fab</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Roche</td>
<td>11214667001</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Tosyl Activated Beads</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Dynal/Invitrogen</td>
<td>142-03</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Magnetic Separator</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>Dynal MPC</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>3-aminopropyl-triethoxysilane</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>A3648</td>
<td>Other aminosilanes can be used or mixed with non-amine reactive silanes for sparser surfaces</td>
</tr>
<tr>
<td>Succinimidyl propionate PEG</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Nektar</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Similar PEGs can be purchased from Nanocs, CreativePEGWorks, etc.</td>
</tr>
<tr>
<td>Biotin-PEG-NHS</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Nektar</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Similar PEGs can be purchased from Nanocs, CreativePEGWorks, etc.</td>
</tr>
<tr>
<td>Double-sided tape</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Grace BioLabs</td>
<td>SA-S-1L</td>
<td>100 &mu;m thickness</td>
</tr>
<tr>
<td>Quartz slide</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Technical Glass</td>
<td>20 mm (W)x 50 mm (L)x 1mm (H)</td>
<td>Size to fit on coverslips. Drill holes with diamond-tip drill bits (DiamondBurs.net)</td>
</tr>
<tr>
<td>Polyethylene tubing</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Becton Dickinson</td>
<td>427416</td>
<td>0.76 mm ID, 1.22 OD 
Other size tubing can be substituted.</td>
</tr>
<tr>
<td>Streptavidin</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>S4762</td>
<td>Make 1 mg/mL solution, 25 &mu;L aliquots in PBS pH 7.3</td>
</tr>
<tr>
<td>Deoxyribonucleotide triphosphate solution mix</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>New England Biolabs</td>
<td>N0447</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Inverted Optical Microscope with 10X Objective</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Olympus</td>
<td>Olympus IX-51</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Permament rare-earth magnet</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>National Imports</td>
<td>www.rare-earth-magnets.com</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>CCD Camera</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>QImaging</td>
<td>Rolera-XR Fast 139</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Syringe Pump</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Harvard Apparatus</td>
<td>11 Plus</td>
<td>Operate in refill mode to facilitate solution changes</td>
</tr>
<tr>
<td>Fiber Illuminator</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Thorlabs Inc.</td>
<td>OSL1</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

direct observation of enzymes replicating dna using a single-molecule dna stretching assay

Vi beskriver en metod för att observation realtid replikering av enskilda DNA-molekyler förmedlas av proteiner från bakteriofag replikering systemet. Linjäriserade λ DNA är modifierad så den har en biotin på slutet av en tråd, och en digoxigenin fraktionen i andra änden av samma tråd. Den biotinylerad änden är ansluten till en functionalized glas täckglas och digoxigeninated slut på en liten pärla. Monteringen av dessa DNA-sträng tjuder på ytan av ett flöde cell gör ett laminärt flöde som skall tillämpas för att utöva en dragkraft på pärlan. Som ett resultat, är DNA sträcks nära och parallellt med ytan på täckglas vid en kraft som bestäms av flödet (Figur 1). Längden på DNA mäts genom att övervaka läget för pärla. Längd skillnader mellan enkel-och dubbelsträngat DNA används för att få information i realtid om verksamheten för replikering proteiner på gaffeln. Mätning av läge pärla ger en exakt bestämning av priser och processivities av DNA varva ner och polymerisation (figur 2).

Watch this Scientific Journal Video about Direct Observation of Enzymes Replicating DNA Using a Single-molecule DNA Stretching Assay at JoVE.com

Direct Observation of Enzymes Replicating DNA Using a Single-molecule DNA Stretching Assay

Vi beskriver en metod för att observation realtid replikering av enskilda DNA-molekyler förmedlas av proteiner från bakteriofag replikering systemet.

Direkt observation av enzymer Replikera DNA med en enda molekyl DNA Stretching analys

We describe a method for observing real time replication of individual DNA molecules mediated by proteins of the bacteriophage replication system. ...

Research

JoVE Journal

Biology

Visualizing Single-molecule DNA Replication with Fluorescence Microscopy

Visualisera enda molekyl DNA-replikering med fluorescensmikroskopi

We describe a simple fluorescence microscopy-based real-time method for observing DNA replication at the single-molecule level. A circular, forked DNA ...

DNA Stable-Isotope Probing (DNA-SIP)

DNA Stable-Isotope Probing DNA-SIP

DNA Stabil-Isotope Probing (DNA-SIP)

DNA stable-isotope probing (DNA-SIP) is a powerful technique for identifying active microorganisms that assimilate particular carbon substrates and ...

Primer-Free Aptamer Selection Using A Random DNA Library

Primer-Free aptamer Val användning av ett slumpmässigt DNA-bibliotek

Aptamers are highly structured oligonucleotides (DNA or RNA) that can bind to targets with affinities comparable to antibodies 1. They are identified ...

Generation of RNA/DNA Hybrids in Genomic DNA by Transformation using RNA-containing Oligonucleotides

Generering av RNA / DNA-hybrider i Genomiskt DNA genom omvandling med hjälp av RNA-innehållande oligonukleotider

Synthetic short nucleic acid polymers, oligonucleotides (oligos), are the most functional and widespread tools of molecular biology. Oligos can be ...

Preparation of DNA-crosslinked Polyacrylamide Hydrogels

Framställning av DNA-tvärbundet Polyacrylamide Hydrogeler

Mechanobiology is an emerging scientific area that addresses the critical role of physical cues in directing cell morphology and function. For example, ...

Combining Single-molecule Manipulation and Imaging for the Study of Protein-DNA Interactions

Kombinera enda molekyl manipulation och Imaging för studier av protein-DNA-interaktioner

The paper describes the combination of optical tweezers and single molecule fluorescence detection for the study of protein-DNA interaction. The method ...

Real-time Imaging of Single Engineered RNA Transcripts in Living Cells Using Ratiometric Bimolecular Beacons

Realtid avbildning av Single Engineered RNA transkript hos levande celler Använda Propportionell bimolekylär Beacons

The growing realization that both the temporal and spatial regulation of gene expression can have important consequences on cell function has led to the ...

Studying DNA Looping by Single-Molecule FRET

Studera DNA Looping med enda molekyl FRET

Bending of double-stranded DNA (dsDNA) is associated with many important biological processes such as DNA-protein recognition and DNA packaging into ...

Reduced-gravity Environment Hardware Demonstrations of a Prototype Miniaturized Flow Cytometer and Companion Microfluidic Mixing Technology

Minskad gravitations Miljö Hårdvara Demonstrationer av en prototyp Miniaturized flödescytometer och Companion mikroflödes Mixing Technology

Until recently, astronaut blood samples were collected in-flight, transported to earth on the Space Shuttle, and analyzed in terrestrial laboratories. If ...

A Proteoliposome-Based Efflux Assay to Determine Single-molecule Properties of Cl- Channels and Transporters

A Proteoliposome-Based Efflux Assay to Determine Single-molecule Properties of Cl- Channels and Transporters

En Proteoliposome-Based Efflux analys för att bestämma enda molekyl egenskaper Cl<sup&gt; -</sup&gt; Kanaler och Transportörer

The last 15 years have been characterized by an explosion in the ability to overexpress and purify membrane proteins from prokaryotic organisms as well as ...