Name: toxin induction and protein extraction from fusarium spp. cultures for proteomic studies
Uploaded: 2010-02-16T15:05:00
Duration: 8 min 19 s
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Agradecemos a Servane Contal e Boris Untereiner por sua contribuição técnica. Agradecemos o apoio da FNR &quot;FUTOX&quot; do projeto.

O protocolo exige que 16 dias para sua conclusão. O prazo é detalhado na figura 1. Detalhes para a preparação de buffer <ul><li> Preparação do tampão de lise (3mL por amostra). </li><li> Preparação do tampão de lavagem (50 ml por amostra). Esta reserva deve ser pré-refrigerados e armazenados a -20 ° C no freezer até análise mais aprofundada e mantidos em gelo durante todo o procedimento. </li><li> Preparação do tampão de precipitação (20 mL por amostra). Esta reserva deve ser pré-refrigerados e armazenados a -20 ° C no freezer até que seja necessário e mantidos em gelo durante todo o procedimento. </li><li> O trabalho deve preferencialmente ser realizado em câmara fria a 4 ° C. </li></ul> Espécies de fungos Três cepas utilizadas para análises proteômicas foram classificadas a Fusarium graminearum, com base em suas características morfológicas e Tradução Alongamento-Alpha-1 fator de análise (O&#39;Donnell et al., 1998) Essas cepas pertenciam à coleção Lippmann CRP-Gabriel e foram mantidos e armazenados a - 80 ° C em 15% de glicerol. Preparação dos micélios Fungos foram cultivados em V8 de 4 dias a 25 ° C alternadas período de claro e escuro a cada 12 hrs. Culturas foram fragmentados utilizando uma lâmina estéril e peças dessas culturas foram utilizadas para inocular balões de 250 ml Erlenmeyer contendo 100 mL da toxina induzindo-media. Micélios foram colhidas após 10 dias e foram separados do meio por filtração a cultura com um filtro estéril. Micélios foram lavadas 3 vezes com água estéril para remover resíduos de médio e outros compostos. Em seguida, imediatamente congelou as células pela adição de nitrogênio líquido e mantidas as amostras a -80 ° C. Descrição geral da extração de proteínas Amostras de proteínas foram extraídas com o método descrito na figura 3A e 3B. As amostras de Fusarium foram moídas em nitrogênio líquido eo pó foram recolhidos em 10 ml tubos de Teflon. As amostras foram então incubadas 30 minutos com o tampão de lise, cozidos por 10 minutos, e centrifugado duas vezes a temperatura ambiente (12000g por 15 minutos). Os sobrenadantes foram coletados e incubados a -20 ° C com tampão de precipitação durante a noite. Após centrifugação a 4 ° C 30000g por 45 minutos, as bolinhas das proteínas precipitadas foram lavadas três vezes com acetona gelada contendo DTT. Finalmente, as pelotas foram secas ao ar e as proteínas foram ressolubilizam no buffer de rotulagem, ajustando o pH a 8. A sub-amostra de 30 ml foi removido para a quantificação de proteínas totais eo sobrenadante restante foi armazenado a -20 ° C até eletroforese de proteínas. <img src="/files/ftp_upload/1690/1690fig1.jpg" alt="Figura 1" /> Figura 1. Timeline do procedimento. <img src="/files/ftp_upload/1690/1690fig2.jpg" alt="Figura 2" /> Figura 2. Esquema para múltiplos operadores de processamento de amostra. <img src="/files/ftp_upload/1690/1690fig3atmb.jpg" alt="Figura 3a" border="0" /> Figura 3a. <img src="/files/ftp_upload/1690/1690fig3btmb.jpg" alt="Figura 3b" border="0" /> Figura 3b. Por favor, <a href="/files/ftp_upload/1690/1690fig3a.jpg">clique aqui</a> para ver uma versão ampliada da figura 3a, ou <a href="/files/ftp_upload/1690/1690fig3b.jpg">aqui</a> para uma versão ampliada da figura 3b. Figuras 3a-b Fluxogramas para o procedimento de extração de proteínas (A: primeiro dia; B: segundo dia).. <img src="/files/ftp_upload/1690/1690fig4tmb.jpg" alt="Figura 4" border="0" /> Figura 4. 1D imagem de extratos de proteína. Proteínas foram executados até a migração completa do azul para o final do gel que foi manchada com roxo lava. Por favor, <a href="/files/ftp_upload/1690/1690fig4.jpg">clique aqui</a> para ver uma versão ampliada da figura 4.

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	<li>Bridge, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+Extraction+from+Fungi.">Protein Extraction from Fungi.</a> Protein Purification Protocols. , 39-48 (1996).</li><li>Jiao, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+different+carbon+sources+on+trichothecene+production+and+Tri+gene+expression+by+Fusarium+graminearum+in+liquid+culture.">Effects of different carbon sources on trichothecene production and Tri gene expression by Fusarium graminearum in liquid culture.</a> FEMS Microbiol Lett. 285, 212-219 (2008).</li><li>Kim, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteomics+of+filamentous+fungi.">Proteomics of filamentous fungi.</a> Trends in Biotechnology. 25, 395-400 (2007).</li><li>Milles, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+proteomic+approach+to+monitor+protein+synthesis+in+mycotoxin+producing+moulds.">Development of a proteomic approach to monitor protein synthesis in mycotoxin producing moulds.</a> Mycotoxin Res. 23, 161-165 (2007).</li><li>Morrison, N., Field, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Concept+of+sample+in+OMICS+technology.">Concept of sample in OMICS technology.</a> OMICS. 10, 127-137 (2006).</li><li>O'Donnell, K., Kistler, H. C., Cigelnik, E., Ploetz, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiple+evolutionary+origins+of+the+fungus+causing+Panama+disease+of+banana:+Concordant+evidence+from+nuclear+and+mitochondrial+gene+genealogies.">Multiple evolutionary origins of the fungus causing Panama disease of banana: Concordant evidence from nuclear and mitochondrial gene genealogies.</a> PNAS. 95, 2044-2049 (1998).</li><li>Paper, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+proteomics+of+extracellular+proteins+in+vitro+and+in+planta+from+the+pathogenic+fungus+Fusarium+graminearum.">Comparative proteomics of extracellular proteins in vitro and in planta from the pathogenic fungus Fusarium graminearum.</a> Proteomics. 7, 3171-3183 (2007).</li><li>Pasquali, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Video+in+science.+Protocol+videos:+the+implications+for+research+and+society.">Video in science. Protocol videos: the implications for research and society.</a> EMBO Rep. 8, 712-716 (2007).</li><li>Taylor, C. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+minimum+information+about+a+proteomics+experiment+(MIAPE).">The minimum information about a proteomics experiment (MIAPE).</a> Nat Biotechnol. 25, 887-893 (2007).</li><li>Taylor, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteomic+analyses+of+Fusarium+graminearum+grown+under+mycotoxin-inducing+conditions.">Proteomic analyses of Fusarium graminearum grown under mycotoxin-inducing conditions.</a> Proteomics. 8, 2256-2265 (2008).</li></ol>

Recente interesse em abordagens proteômicas no domínio da biologia de fungos levou a um aumento do número de publicações com essa técnica (como revistas em Kim et al., 2007). Métodos para a extração de proteínas dependem de uma combinação de procedimentos de extração, que são muitas vezes mal descritos nas seções metodológicas e requerem conhecimento especializado para lidar com os métodos de solução de problemas em potencial. Como para outros &quot;ómicas&quot; abordagens, estabelecendo normas para o processamento de amostras e dados é essencial a fim de gerar informações científicas confiáveis. Além disso as amostras e os procedimentos de manipulação devem ser adequadamente descritos de modo a permitir interpretação dos resultados compartilhados entre os diferentes &quot;ómicas&quot; experimentos. Isso seria essencial para a plena exploração do potencial cross-de mineração de dados em genômica, proteômica, metabolômica, ... (Morrison et al., 2006). Informações mínimas sobre um experimento proteômica foi elaborado e grupos de trabalho foram criados de forma a gerir todos os aspectos de uma experiência (de eletroforese em gel, Espectrometria de Massa, interações moleculares, modificações de proteínas, Informática Proteomics, o processamento da amostra). No momento nenhuma informação definida estão disponíveis em procedimentos de processamento da amostra. Dada a importância dos procedimentos de extração da proteína para determinar a qualidade final dos estudos de proteômica, a fim de implementar procedimentos que podem aumentar a padronização no âmbito das diretrizes MIAPE (Taylor et al., 2007), propusemos o uso de um protocolo de vídeo detalhando amostra processamento. Descrição do vídeo de experimentos pode contribuir substancialmente para aumentar o número de informações sobre o processamento da amostra, que pode resultar em melhor reprodutibilidade de &quot;ómicas&quot; experimentos (Pasquali, 2007). Na verdade, toda a reprodutibilidade laboratórios é um requisito fundamental para garantir a validade dos resultados proteômica (http://www.fixingproteomics.org). A reprodutibilidade cruz laboratório é influenciado por dois fatores: instrumentações diferentes e diferentes operadores manipulando as amostras. No protocolo descrito, propomos a realizar replica biológica envolvendo múltiplos operadores (Figura 2 e vídeo) para aumentar a confiabilidade dos dados (ou seja, variação da técnica dos resultados é levado em conta). O procedimento descrito para a extração de proteínas é baseado em SDS e aquecimento. Isto foi demonstrado anteriormente para garantir uma pureza e boa quantidade de proteínas (Bridge, 1996). SDS juntamente com ebulição dissolve as paredes das células, as proteínas hidrofóbicas e impede a formação de oligômeros que a precipitação de proteínas abortar. Ebulição permite também a inativação de proteases. O mesmo efeito é produzido também por EDTA, PMSF e inibidor da protease completa mini. TDT remove pontes dissulfeto e entre proteínas facilitando a solubilização da proteína. A fim de remover antes IEF SDS, as proteínas são precipitadas por acetona / TCA / TDT. Além disso, acetona / TCA / TDT precipitação permite remover alguns contaminantes, tais como lipídios, ácidos nucléicos, sais e / ou compostos fenólicos, quando estes compostos estão presentes. Como SDS, estas moléculas evitar uma migração bem durante IEF. Seguindo essa precipitação, é necessário lavar as proteínas precipitadas com acetona / DTT, a fim de remover TCA, pois ele pode interferir com IEF. A preparação da amostra boa é a chave para bons resultados. Para isso, é também essencial para evitar a contaminação de proteínas do ambiente de trabalho com luvas sem pó e respeitando as boas práticas laboratoriais. Do ponto de vista técnico, dentro do protocolo descrito, os passos mais críticos para obtenção de quantidades suficientes e pureza de proteínas são duas fases. Primeiro, a fase de moagem onde a destruição completa da célula é fundamental para a liberação de proteínas e, segundo, a purificação de proteínas totais, uma fase que engloba a remoção da maioria dos lipídios DNA, e outros contaminantes que possam interferir com a migração de proteínas.

Mídia e soluções PDA: 39 g Batata Dextrose Agar (Difco), 1 L de água destilada. V8 agar: 200 ml V8 (Campbell, EUA), 2g CaCO3 (Sigma), Agar 16g (DIFCO), 800 ml de água destilada Toxina mídia induzindo: 1g K 2 HPO 4, 0,5 g KCl, 0,5 g MgSO 4 7H 2 O, 10 mg FeEDTA, 2g L ácido glutâmico, sacarose 10g em 1L de água destilada. Tampão de Lise: <table border="1"><tr><td></td><td> 100mL </td><td> Concentração final </td><td></td></tr><tr><td> Tris-HCL PH8 </td><td> 5mL </td><td> 50mM </td><td> 1M </td></tr><tr><td> SDS </td><td> 2g ou 10 ml </td><td> 2% </td><td> 20% </td></tr><tr><td> TDT </td><td> 500mL </td><td> 10mM </td><td> 2M </td></tr><tr><td> EDTA </td><td> 20mL </td><td> 0,1 mM </td><td> 0.5M </td></tr><tr><td> PMSF </td><td> 200mL </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Inibidor da protease completa mini- </td><td> 1 comprimido </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Água </td><td> Qsp </td><td></td><td></td></tr></table> Tampão de precipitação: <table border="1"><tr><td></td><td> 100mL </td><td> Concentração final </td></tr><tr><td> TCA </td><td> 20mL </td><td> 20% </td></tr><tr><td> TDT </td><td> 0,1 ml </td><td> 0,1% </td></tr><tr><td> Acetona </td><td> Qsp </td><td></td></tr></table> Lavar Buffer: <table border="1"><tr><td></td><td> 100mL </td><td> Concentração final </td></tr><tr><td> TDT </td><td> 0,1 ml </td><td> 0,1% </td></tr><tr><td> Acetona </td><td> 100mL </td><td></td></tr></table> Rotulagem de buffer (armazenamento a -18 ° C em alíquotas pequenas): <table border="1"><tr><td></td><td> 1mL </td><td> Concentração final </td></tr><tr><td> Uréia </td><td> 140 mg </td><td> 7M </td></tr><tr><td> Tiouréia </td><td> 50 mg </td><td> 2M </td></tr><tr><td> CHAPS </td><td> 40 mg </td><td> 4% </td></tr><tr><td> Tris </td><td> 30 mL </td><td> 30 mM </td></tr><tr><td> Água </td><td> 1 mL </td><td></td></tr></table>

toxin induction and protein extraction from fusarium spp. cultures for proteomic studies

Fusaria são fungos filamentosos capazes de produzir toxinas diferentes. Micotoxinas Fusarium, como o desoxinivalenol, nivalenol, T2, zearelenone, ácido fusárico, moniliformin, etc .. ter efeitos adversos na saúde humana e animal e alguns são considerados como fatores de patogenicidade. Estudos de proteômica mostrou-se eficaz para decifrar os mecanismos de produção de toxinas (Taylor et al., 2008), bem como para a identificação de fatores patogênicos em potencial (Paper et al. 2007, Houterman et al., 2007) em Fusaria. Torna-se, portanto, fundamental para estabelecer métodos confiáveis ​​para a comparação entre os estudos de proteômica, a fim de contar com verdadeiras diferenças encontradas na expressão da proteína entre os experimentos, as cepas e laboratórios. O procedimento que será descrito deverá contribuir para um maior nível de padronização de procedimentos proteômica de duas maneiras. O protocolo filmado é usado para aumentar o nível de detalhes que pode ser descrito com precisão. Além disso, a disponibilidade de procedimentos padronizados para processo biológico replica deve garantir uma maior robustez dos dados, tendo em conta também o fator humano dentro da reprodutibilidade técnica do processo de extração. O protocolo descrito requer 16 dias para sua conclusão: 14 dias para as culturas e dois dias para a extração de proteínas (figura 1). Resumidamente, Fusarium cepas são cultivadas em meios sólidos por 4 dias, pois eles são, então, manualmente fragmentado e transferido para uma mídia toxina modificada indução (Jiao et al, 2008.) Por 10 dias. Micélio é coletado por filtração através de uma camada Miracloth. Moagem é realizada em uma câmara fria. Diferentes operadores realizada extração de repetições (n = 3), a fim de ter em conta o viés devido a variações técnica (figura 2). Extração foi baseado em um tampão SDS / TDT conforme descrito em Taylor et al. (2008) com ligeiras modificações. Extração de proteína total necessário um processo de precipitação das proteínas com acetona / TCA / TDT tampão de lavagem durante a noite e acetona / TDT (figura 3a, 3b). Proteínas foram finalmente ressolubilizam no buffer de proteína rotulagem e quantificados. Resultados da extração foram visualizados em gel 1D (Figura 4, SDS-PAGE), antes de prosseguir para 2D géis (IEF / SDS-PAGE). O mesmo procedimento pode ser aplicado para análises proteômicas em outros suportes de cultura e outros fungos filamentosos (Miles et al., 2007).

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Toxin Induction and Protein Extraction from Fusarium spp. Cultures for Proteomic Studies

Extração de proteínas para análise proteômica em espécies de fungos requer um alto nível de padronização a ser realizado de acordo com as informações mínimas sobre um experimento proteômica (MIAPE) orientações. Nós apresentamos um vídeo protocolo que inclui um procedimento para minimizar viés experimental durante a indução da toxina e extração de proteínas de<em&gt; Fusarium spp.</em

Indução toxina e Extração de Proteínas de Fusarium Spp. Culturas de Estudos Proteômica

Fusaria are filamentous fungi able to produce different toxins. Fusarium mycotoxins such as deoxynivalenol, nivalenol, T2, zearelenone, fusaric acid, ...

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