Name: puramatrix encapsulation of cancer cells
Uploaded: 2009-12-17T17:00:00
Duration: 7 min 8 s
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Notas técnicas: <ul><li> Gelificação é iniciada pela adição de sais. Portanto, é fundamental que não sais de entrar em contato com PuraMatrix até gelificação é desejado; exposição a sais de muito baixa força iônica (eg, &lt;0,05 M) fará com que gelificação irreversível. </li><li> Soluções estoque restante que está preparado pode ser usado em uma data posterior, desde que não tenham entrado em contato com sais. Você não precisa se preocupar com sonicação repetir. </li><li> Bolhas de ar podem ser removidas PuraMatrix alíquotas em tubos estéreis, seguido por centrifugação. </li><li> Tenha muito cuidado durante as mudanças de mídia como aspiração podem facilmente perturbar a cama PuraMatrix. </li></ul> Materiais: BD PuraMatrix Peptide Hydrogel RAD16-1% (Cat # 354250): A concentração de peptídeo total da mistura não diluída é de 10 mg / ml. <ul><li> Sonicador água Banheira ou Vortex </li><li> De 96 poços prato de cultura de células </li><li> Meios de Cultura de células </li><li> Estéril Filtrado H 2 O </li><li> Sacarose filtrado estéril 20% </li><li> Células (todos menos 5.000 células / poço): OVCAR-5 </li></ul> Todos os passos devem ser realizados sob condições assépticas. Procedimento: <ol><li> Sonicate o PuraMatrix 1% (RAD16) em um sonicador banho-maria durante 30 minutos para reduzir a viscosidade antes do uso. </li><li> A solução PuraMatrix 1% pode agora ser aliquotado em tubos estéreis a simplificar experiências futuras. <ol class="lalpha"><li> Evitar a formação de bolhas de ar, se elas formam simplesmente girar os tubos estéreis, contendo PuraMatrix a 1000 rpm (300 xg) por 5 minutos. </li><li> A concentração de peptídeo total da mistura não diluída é de 10 mg / ml. </li></ol></li><li> Dois conjuntos de quatro poços serão banhados em 2,5 mg / ml e 1,25 mg / ml de concentração de peptídeo total, respectivamente. </li><li> Diluir o PuraMatrix em cada bem definido com 0,2 m estéril filtrado sacarose 20% e sacarose 13,3% para concentrações totais de peptídeo de 5 mg / ml e 2,5 mg / ml, respectivamente, para alcançar uma concentração 2x de BD PuraMatrix em sacarose 10%. <ol class="lalpha"><li> Fazer sacarose 20%, diluir 10 g de sacarose, em seguida, o volume a 50 ml de água. </li><li> 13% de sacarose e 10% podem ser preparadas por diluição da solução estoque de 20%. <ol class="lroman"><li> 13% de sacarose (para cada 10 ml): 6,5 ml de sacarose 20% + 3,5 ml estéril H 2 O. </li><li> 10% Sacarose (para cada 10 ml): 5,0 ml de sacarose 20% + 5,0 ml estéril H 2 O. </li></ol></li></ol></li><li> Prepare uma mistura mestre de peptídeo PuraMatrix com base no número de poços que pretende prato. (Veja o exemplo abaixo.) Então alíquotas em tubos individuais contendo 25 ml da mistura de mestre. <ol class="lalpha"><li> O master mix deve ser preparado com o dobro da concentração final desejada de peptídeo total como ele vai ser diluído com igual volume de células durante a galvanização. <img src="/files/ftp_upload/1692/1692_fig11.jpg" alt="figura 1" /></li></ol></li><li> Preparar suspensões de células por trypsinizing culturas de células de células em monocamada. <ol class="lalpha"><li> 2 ml de 0,05% Tripsina EDTA pode ser usado para cada Flask T-75. </li></ol></li><li> Neutralizar a tripsina com a adição de meios de cultura celular contendo 10% de calor soro fetal bovino inativado (uso pelo menos 2 ml de mídia por ml de tripsina usada na etapa anterior.) </li><li> Centrifugar as células a 1000 rpm (~ 300 xg) por 5 minutos para criar um pellet de células. <ol><li> Ressuspender as células em 10% de sacarose estéril filtrado. </li><li> Contar as células e spin para baixo novamente a 1000 rpm (~ 300 xg) por 5 minutos para remover traços de sal encontrados na mídia. </li></ol></li><li> Ressuspender as células OVCAR-5 em sacarose 10% a 2.0 x 10 5 células / ml para que a contagem de células por poço finais serão 5.000 células em cada poço. Os seguintes passos devem ser realizados rapidamente. </li><li> Adicionar 25 mL do 2,0 x 10 5 células / ml de suspensão para o primeiro tubo contendo 25 mL individuais do mix de mestre de PuraMatrix como mostrado no esquema acima. <ol class="lalpha"><li> Rapidamente mix por pipetagem (~ 5 vezes para cima e para baixo) no tubo sem a introdução de bolhas de ar. </li><li> Em seguida, pipetar 50 ul da célula mistura suspensão / PuraMatrix no poço apropriado de um prato de 96 poços. </li><li> Iniciar a gelificação do PuraMatrix BD com cuidado pipetando 150 media de células mL de cultura (RPMI + 10% FBS) para o lado do bem <img src="/files/ftp_upload/1692/1692_fig12.jpg" alt="figura 2" /></li></ol></li><li> Repita os passos descritos no 8 até que todos os poços foram banhados. </li><li> Depois de 30 minutos Muito Remova cuidadosamente ~ 2 / 3 dos meios de comunicação utilizando uma pipeta 200 mL para equilibrar o pH do hidrogel. <ol class="lalpha"><li> NÃO USE A aspirador a vácuo como isso irá interromper o MATRIX </li><li> Coloque a ponta da pipeta no poço, para queele não toque na cama PuraMatrix e delicadamente remova a mídia do poço. </li><li> Cuidados devem ser tomados para não perturbar a matriz durante a cultura de células em PuraMatrix. </li></ol></li><li> Muito delicadamente adicionar 150 mL de meio de cultura de células frescas ao lado das células que contêm bem encapsulado em PuraMatrix. </li><li> Alterar a mídia de cultura de células em cada poço a cada 48 horas, com meios de cultura fresco com cuidado repetindo os passos 10 e 11. </li></ol> Resultados representativos: <img src="/files/ftp_upload/1692/1692_fig1tmb.jpg" alt="figura 1" border="0" /> Figura 1. OVCAR-5 células foram encapsulados como descrito no protocolo acima. Imagens foram adquiridas usando uma invertida Olympus FV1000 microscópio equipado com Ti-DeepSee Spectra Physics: Sapphire a laser ajustado para 750 nm. Sessões de imagem foram realizados nos dias 1, 3, 5 e 7 pós-plating. A longa distância de trabalho de água, mergulhando objetiva de 40x (Olympus LUMPLFLN 0,8 NA) foi usado para a imagem através da PuraMatrix. Volumes tridimensionais foram coletados através da aquisição de pilhas de imagens em 1,47 mM passos axial. Duas organizações não-descanned detectores coletados a emissão autofluorescência utilizando violeta (440-490 nm) e verde (510-550 nm) filtros passa-banda. As imagens finais e filmes pilha de profundidade foram processadas utilizando ImageJ, combinando ambos os canais de detecção. Por favor, <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/1692/1692_fig1.jpg">clique aqui</a> para ver uma versão ampliada da figura 1.

<ol>
	<li>Gelain, F., Bottai, D., Vescovi, A., Zhang, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Designer+self-assembling+Peptide+nanofiber+scaffolds+for+adult+mouse+neural+stem+cell+3-dimensional+cultures.">Designer self-assembling Peptide nanofiber scaffolds for adult mouse neural stem cell 3-dimensional cultures.</a> PLoS One. 1, e119-e119 (2006).</li></ol>

puramatrix encapsulation of cancer cells

Crescente evidência sugere que as células cancerosas cultura em três dimensões com mais precisão recapitula a complexidade da biologia tumoral. Muitos destes modelos utilizam membrana basal reconstituída derivados de animais que contêm uma quantidade variável de fatores de crescimento e citocinas que podem influenciar o crescimento desses modelos de cultura de células. Aqui, descrevemos em detalhes a preparação eo uso de PuraMatrix, um disponível comercialmente auto gel montagem peptídeo que é desprovido de materiais de origem animal e patógenos para encapsular e propagar a linha de células de câncer de ovário, OVCAR-5. Começamos por descrever como preparar o PuraMatrix antes do uso. Em seguida, demonstrar como misturar corretamente o PuraMatrix e suspensão de células para encapsular as células do hidrogel. Após a adição de meios de cultura celular ou injeção em um ambiente fisiológico, o componente de peptídeo PuraMatrix rapidamente auto monta em um hidrogel 3D que exibe um nanômetro estrutura fibrosa escala com um tamanho médio dos poros de 500-200 nm<sup&gt; 1</sup&gt;. Além disso, demonstramos como propagar culturas cultivadas em PuraMatrix encapsulados. Quando encapsulado em PuraMatrix, OVCAR-5 células reúnem-se em três estruturas acinares dimensional que mais se assemelham a morfologia dos nódulos micrometastático observados na prática clínica de monocamada em modelos in vitro. Usando a microscopia confocal, ilustramos o surgimento de representante OVCAR-5 células encapsuladas em PuraMatrix no dia 1, 3, 5 e 7 plating post. O uso de PuraMatrix às células cancerosas cultura deve melhorar a nossa compreensão da doença e permitem avaliar a resposta ao tratamento em sistemas modelo mais preditivo clinicamente.

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PuraMatrix Encapsulation of Cancer Cells

Este vídeo demonstra como para encapsular e células cancerosas em cultura PuraMatrix, um auto comercialmente disponíveis montagem gel peptídeo.

Encapsulation PuraMatrix de células de câncer

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