Name: puramatrix encapsulation of cancer cells
Uploaded: 2009-12-17T17:00:00
Duration: 7 min 8 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about PuraMatrix Encapsulation of Cancer Cells at JoVE.com

Технические примечания: <ul><li> Гелеобразование инициируется добавлением соли. Поэтому, очень важно, что ни соли вступают в контакт с PuraMatrix до гелеобразования желательно; воздействия соли очень низкой ионной силы (например, &lt;0,05 М) приведет к необратимым гелеобразования. </li><li> Оставшийся запас решений, которые готовы могут быть использованы позднее, если они не вступают в контакт с солями. Вам не нужно беспокоиться о том повторить ультразвуком. </li><li> Пузырьки воздуха могут быть удалены aliquoting PuraMatrix в стерильные пробирки с последующим центрифугированием. </li><li> Будьте очень осторожны при изменении СМИ как стремление может легко нарушить PuraMatrix постели. </li></ul> Материалы по теме: BD PuraMatrix RAD16 пептида Гидрогель-1% (Cat # 354250): общая концентрация пептида неразбавленной смеси составляет 10 мг / мл. <ul><li> Вода Sonicator Ванная или Vortex </li><li> 96-луночного блюдо культуре клеток </li><li> Медиа культуре клеток </li><li> Стерильные Фильтрованный H 2 O </li><li> Стерильные Фильтрованный 20% сахарозы </li><li> Cells (всего на 5000 клеток / лунку): OVCAR-5 </li></ul> Все шаги должны быть выполнены в асептических условиях. Порядок действий: <ol><li> Разрушать ультразвуком 1% PuraMatrix (RAD16) в sonicator водяной бане в течение 30 минут, чтобы уменьшить вязкость перед использованием. </li><li> 1% PuraMatrix решения теперь могут быть аликвоты в стерильные пробирки для упрощения будущих экспериментов. <ol class="lalpha"><li> Избегайте образования пузырьков воздуха, а если они образуют просто спином вниз стерильные пробирки, содержащие PuraMatrix при 1000 оборотов в минуту (300 мкг) в течение 5 минут. </li><li> Общей концентрации пептида неразбавленном смеси составляет 10 мг / мл. </li></ol></li><li> Два подхода по 4 скважины будут покрыты в дозе 2,5 мг / мл и 1,25 мг / мл общей концентрации пептида, соответственно. </li><li> Развести PuraMatrix в каждой лунке комплекте с 0,2 мкм стерильно фильтруют 20% сахарозы и 13,3% сахарозы к общей пептидной концентрации 5 мг / мл и 2,5 мг / мл, соответственно, для достижения 2x концентрация BD PuraMatrix в 10% сахарозы. <ol class="lalpha"><li> Сделать 20% сахарозы, развести 10 г сахарозы, то объем до 50 мл воды. </li><li> 13% и 10% сахарозы может быть получен путем разбавления 20% маточного раствора. <ol class="lroman"><li> 13% сахарозы (на каждые 10 мл): 6,5 мл 20% сахарозы + 3,5 мл стерильного H 2 O. </li><li> 10% сахарозы (на каждые 10 мл): 5,0 мл 20% сахарозы + 5,0 мл стерильного H 2 O. </li></ol></li></ol></li><li> Подготовка мастер смесь пептидных PuraMatrix в зависимости от количества скважин вы собираетесь пластины. (См. пример ниже). Затем аликвоту в отдельные пробирки с 25 мл мастера микса. <ol class="lalpha"><li> Мастер смесь должна быть готова в два раза желаемой конечной концентрации общего пептида, как это будет разбавляют равным объемом клеток в процессе металлизации. <img src="/files/ftp_upload/1692/1692_fig11.jpg" alt="Рисунок 1" /></li></ol></li><li> Подготовка клеточные суспензии по trypsinizing культурах клеток монослоя клеток. <ol class="lalpha"><li> 2 мл 0,05% трипсина ЭДТА может быть использована для каждого Т-75 Flask. </li></ol></li><li> Нейтрализовать трипсина путем добавления культуры клеток, содержащих 10% тепла инактивированной эмбриональной телячьей сыворотки (использовать не менее 2 мл среды на мл трипсина использовали на предыдущем шаге.) </li><li> Центрифуга клетки при 1000 оборотов в минуту (~ 300 мкг) в течение 5 минут, чтобы создать клеточный осадок. <ol><li> Ресуспендируют клеток в 10% стерильно фильтруют сахарозы. </li><li> Граф клеток и со спином вниз снова при 1000 оборотов в минуту (~ 300 мкг) в течение 5 мин для удаления следовых количеств соли содержится в средствах массовой информации. </li></ol></li><li> Ресуспендируют OVCAR-5 клеток в 10% сахарозы, 2,0 х 10 5 клеток / мл, так что окончательное число клеток на лунку будет 5000 клеток в каждую лунку. Следующие шаги должны быть выполнены быстро. </li><li> Добавьте 25 мкл 2,0 х 10 5 клеток / мл суспензии для первого индивидуального пробирку 25 мкл мастер смесь PuraMatrix, как показано на схеме. <ol class="lalpha"><li> Быстро перемешать с помощью пипетки (~ 5 раз вверх и вниз) в трубке без введения пузырьков воздуха. </li><li> Потом пипеткой 50 мкл суспензии клеток / PuraMatrix смесь в соответствующую лунку 96 и блюда. </li><li> Инициировать гелеобразования PuraMatrix BD, осторожно пипетки 150 мкл культуры клеток (RPMI + 10% FBS) в сторону хорошо <img src="/files/ftp_upload/1692/1692_fig12.jpg" alt="Рисунок 2" /></li></ol></li><li> Повторите действия, описанные в 8, пока все скважины были покрыты. </li><li> Через 30 минут очень осторожно удалить ~ 2 / 3 от носителя с помощью 200 мкл пипетки, чтобы уравновесить рН гидрогеля. <ol class="lalpha"><li> НЕ ИСПОЛЬЗУЙТЕ Вакуумный аспиратор, так как это нарушает MATRIX </li><li> Место пипетки в хорошо так, чтобыон не касается PuraMatrix кровать и осторожно извлекайте носитель из колодца. </li><li> Следует проявлять осторожность, чтобы не нарушить матрицы при культуре клеток в PuraMatrix. </li></ol></li><li> Очень осторожно добавить 150 мкл свежей среды культуры клеток в сторону так, содержащих клетки инкапсулированных в PuraMatrix. </li><li> Изменение культуры клеток в каждой лунке каждые 48 часа со свежей культуральной среды, тщательно повторяя шаги 10 и 11. </li></ol> Представитель Результаты: <img src="/files/ftp_upload/1692/1692_fig1tmb.jpg" alt="Рисунок 1" border="0" /> Рисунок 1. OVCAR-5 инкапсулированные клетки, как описано в предыдущем протоколе. Изображения были получены с помощью перевернутого Olympus FV1000 микроскоп с Spectra-Physics DeepSee Ti: Sapphire лазера, настроенного на 750 нм. Изображений сессий были проведены в дни 1, 3, 5 и 7 после металлизации. Большое рабочее расстояние, вода погружения 40x цель (Olympus LUMPLFLN 0,8 NA) был использован для изображения через PuraMatrix. Трехмерная объемы были собраны за счет приобретения изображение стеки в 1,47 мкм осевого шага. Два не-descanned детекторов собраны аутофлюоресценция выбросов использованием фиолетового (440-490 нм) и зеленого (510-550 нм) полосового фильтра. Окончательного изображения и глубину стека фильмы были обработаны с использованием ImageJ путем сочетания обоих каналов обнаружения. Пожалуйста, <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/1692/1692_fig1.jpg">нажмите здесь</a> , чтобы видеть большую версию рисунке 1.

<ol>
	<li>Gelain, F., Bottai, D., Vescovi, A., Zhang, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Designer+self-assembling+Peptide+nanofiber+scaffolds+for+adult+mouse+neural+stem+cell+3-dimensional+cultures.">Designer self-assembling Peptide nanofiber scaffolds for adult mouse neural stem cell 3-dimensional cultures.</a> PLoS One. 1, e119-e119 (2006).</li></ol>

puramatrix encapsulation of cancer cells

Увеличение данные свидетельствуют о том, что клетки рака культивирования в трех измерениях более точно повторяет сложности биологии опухоли. Многие из этих моделей используются восстановленные базальной мембраны, полученных от животных, которые содержат различное количество факторов роста и цитокинов, которые могут влиять на рост этих моделях клеточных культур. Здесь мы подробно описывать подготовку и использование PuraMatrix, имеющихся в продаже самостоятельно сборки пептидной гель, который лишен животного происхождения материала и патогенные для инкапсуляции и распространяются клетка рака яичников линии, OVCAR-5. Мы начнем с описания того, как подготовить PuraMatrix перед использованием. Далее, мы показали, как правильно смешивать PuraMatrix и клеточной суспензии для инкапсуляции клеток в гидрогеля. После добавления культуры клеток или инъекции в физиологической среде, пептидные компоненты PuraMatrix быстро самостоятельно собирает в 3D-гидрогель, который показывает волокнистые структуры нанометрового масштаба с средним размером пор 5-200 нм<sup&gt; 1</sup&gt;. Кроме того, мы показали, как распространяются культуры, выращенные в герметичном PuraMatrix. Когда инкапсулированные в PuraMatrix, OVCAR-5 клетками собираться в трехмерные структуры ацинарных, которые больше напоминают морфологии micrometastatic узелков наблюдается в клинике, чем монослой в моделях пробирке. Использование конфокальной микроскопии мы проиллюстрируем появление представителя OVCAR-5 клетками инкапсулированных в PuraMatrix на 1 день, 3, 5 и 7 после металлизации. Использование PuraMatrix к клеткам рака культуры должны улучшить наше понимание болезни и позволяют нам оценить ответ на лечение в более клинически интеллектуальный модельных системах.

Watch this Scientific Journal Video about PuraMatrix Encapsulation of Cancer Cells at JoVE.com

PuraMatrix Encapsulation of Cancer Cells

Это видео демонстрирует, как для инкапсуляции и культуры клеток рака в PuraMatrix, имеющихся в продаже самостоятельно сборки пептидной геля.

PuraMatrix Инкапсуляция раковых клеток

Increasing evidence suggests that culturing cancer cells in three dimensions more accurately recapitulates the complexity of tumor biology. Many of these ...

Research

JoVE Journal

Biology

Title Cell Encapsulation by Droplets

Название сотовый Инкапсуляция воздушно-капельным путем

Isolation and Analysis of Hematopoietic Stem Cells from the Placenta

Выделение и анализ гемопоэтических стволовых клеток из плаценты

Hematopoietic stem cells (HSCs) have the ability to self-renew and generate all cell types of the blood lineages throughout the lifetime of an individual. ...

Cellular Encapsulation in 3D Hydrogels for Tissue Engineering 

Сотовая Инкапсуляция в 3D гидрогелей для тканевой инженерии

The 3D encapsulation of cells within hydrogels represents an increasingly important and popular technique for culturing cells and towards the development ...

Isolation of Stem Cells from Human Pancreatic Cancer Xenografts

Выделение стволовых клеток из прав ксенотрансплантаты рака поджелудочной железы

Cancer stem cells (CSCs) have been identified in a growing number of malignancies and are functionally defined by their ability to undergo self-renewal ...

Isolation and Culture of Adult Epithelial Stem Cells from Human Skin

Выделение и культуры взрослых Эпителиальные стволовые клетки из человеческой кожи

The homeostasis of all self-renewing tissues is dependent on adult stem cells. As undifferentiated stem cells undergo asymmetric divisions, they generate ...

Flow Cytometry Purification of Mouse Meiotic Cells

Проточной цитометрии Очистка мыши мейоза клетки

The heterogeneous nature of cell types in the testis and the absence of meiotic cell culture models have been significant hurdles to the study of the ...

Ex Vivo Culture of Primary Human Fallopian Tube Epithelial Cells

Ex Vivo Culture of Primary Human Fallopian Tube Epithelial Cells

Экс Vivo культуры первичных человеческих маточных труб эпителиальных клеток

Epithelial ovarian cancer is a leading cause of female cancer mortality in the United States. In contrast to other women-specific cancers, like breast and ...

Visualization of the Interstitial Cells of Cajal (ICC) Network in Mice

Visualization of the Interstitial Cells of Cajal ICC Network in Mice

Визуализация интерстициальные клетки Кахала (МУС) в сети Мыши

The interstitial cells of Cajal (ICC) are mesenchymal derived "pacemaker cells" of the gastrointestinal (GI) tract that generate spontaneous slow waves ...

Isolation of Immune Cells from Primary Tumors

Выделение иммунных клеток из первичной опухоли

Tumors create a unique immunosuppressive microenvironment (tumor microenvironment, TME) whereby leukocytes are recruited into the tumor by various ...

Induction and Analysis of Epithelial to Mesenchymal Transition

Индукционные и анализ эпителиальных к мезенхимальных перехода

Epithelial  to mesenchymal transition (EMT) is essential for proper morphogenesis during  development. Misregulation of this  process has been implicated ...