Name: puramatrix encapsulation of cancer cells
Uploaded: 2009-12-17T17:00:00
Duration: 7 min 8 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about PuraMatrix Encapsulation of Cancer Cells at JoVE.com

Tekniska anm: <ul><li> Gelation initieras genom tillsats av salter. Därför är det viktigt att inga salter kommer i kontakt med PuraMatrix tills gelation önskas, exponering för salter av mycket låg jonstyrka (t.ex. &lt;0,05 M) kommer att orsaka oåterkalleliga gelation. </li><li> Överblivna stamlösningar som är beredda kan användas vid ett senare tillfälle förutsatt att de inte har kommit i kontakt med salter. Du behöver inte oroa dig för att upprepa sonication. </li><li> Luftbubblor kan tas bort alikvotering PuraMatrix i sterila rör följt av centrifugering. </li><li> Var mycket försiktig vid byte av medium som ambition lätt kan störa PuraMatrix sängen. </li></ul> Material: BD PuraMatrix RAD16 Peptid Hydrogel-1% (Cat # 354.250): Den totala peptid koncentrationen av det outspädda blandningen 10 mg / ml. <ul><li> Vattenbad Sonicator eller Vortex </li><li> 96-och cellodling maträtt </li><li> Cell Culture Media </li><li> Sterila Filtrerad H 2 O </li><li> Sterila Filtrerad 20% sackaros </li><li> Celler (alla på 5000 celler / brunn): OVCAR-5 </li></ul> Alla steg måste utföras under aseptiska förhållanden. Förfarande: <ol><li> Sonikera 1% PuraMatrix (RAD16) i ett vattenbad sonicator 30 minuter för att minska viskositeten före användning. </li><li> Den 1% PuraMatrix lösning kan nu konstaterat i sterila rör för att förenkla framtida experiment. <ol class="lalpha"><li> Undvik att luftbubblor bildas, om de utgör bara spinn ner den sterila rör med PuraMatrix vid 1000 rpm (300 xg) i 5 minuter. </li><li> Den totala peptid koncentrationen av det outspädda blandningen 10 mg / ml. </li></ol></li><li> Två uppsättningar av 4 brunnar kommer att vara klädd på 2,5 mg / ml och 1,25 mg / ml totalt peptid koncentration, respektive. </li><li> Späd PuraMatrix i varje brunn set med 0,2 ìm steril filtreras 20% sackaros och 13,3% sackaros till total peptid koncentrationer av 5 mg / ml och 2,5 mg / ml, respektive att åstadkomma en 2x koncentration av BD PuraMatrix i 10% sackaros. <ol class="lalpha"><li> Att tjäna 20% sackaros, späd 10 g sackaros, därefter till 50 ml vatten. </li><li> 13% och 10% sackaros kan beredd genom utspädning av 20% stamlösning. <ol class="lroman"><li> 13% sackaros (för varje 10 ml): 6,5 ml 20% sackaros + 3,5 ml sterilt H 2 O. </li><li> 10% sackaros (för varje 10 ml): 5,0 ml 20% sackaros + 5,0 ml sterilt H 2 O. </li></ol></li></ol></li><li> Förbered en mästare blandning av PuraMatrix peptid baserat på antalet brunnar du tänker tallrik. (Se exempel nedan.) Sen alikvot i enskilda provrör innehållande 25 ml av Master Mix. <ol class="lalpha"><li> Master Mix ska vara beredd på dubbelt så önskade slutliga koncentrationen av totalt peptid eftersom det kommer att spädas med en lika stor mängd celler under plätering. <img src="/files/ftp_upload/1692/1692_fig11.jpg" alt="Figur 1" /></li></ol></li><li> Förbered cellsuspensioner av trypsinizing cellkulturer monolager cell. <ol class="lalpha"><li> 2 ml 0,05% Trypsin EDTA kan användas för varje T-75 kolven. </li></ol></li><li> Neutralisera trypsin genom tillsats av media cellkulturer som innehåller 10% värmeinaktiverad fetalt bovinserum (använd minst 2 ml av media per ml trypsin använts i föregående steg.) </li><li> Centrifugera cellerna vid 1000 rpm (~ 300 xg) i 5 minuter för att skapa en cellpellet. <ol><li> Resuspendera cellerna i 10% filtrerad steril sackaros. </li><li> Räkna celler och snurra ner igen vid 1000 rpm (~ 300 xg) i 5 minuter för att avlägsna spår av salt som finns i media. </li></ol></li><li> Resuspendera OVCAR-5 celler i 10% sackaros vid 2,0 x 10 5 celler / ml så att den slutliga celltal per brunn kommer att bli 5000 celler i varje brunn. Följande steg skall utföras snabbt. </li><li> Tillsätt 25 ìl av 2,0 x 10 5 celler / ml suspension till den första personen röret med 25 l av befälhavaren mix av PuraMatrix som visas i ovanstående schema. <ol class="lalpha"><li> Snabbt blanda genom att pipettera (~ 5 gånger upp och ner) i röret utan att introducera luftbubblor. </li><li> Sedan Pipettera 50 l cellsuspension / PuraMatrix blandningen i rätt väl i en 96 bra maträtt. </li><li> Initiera gelation av BD PuraMatrix genom att försiktigt pipettera 150 l media cellkultur (RPMI + 10% FBS) till sidan av brunnen <img src="/files/ftp_upload/1692/1692_fig12.jpg" alt="Figur 2" /></li></ol></li><li> Upprepa stegen i 8 tills alla brunnar har pläterat. </li><li> Efter 30 minuter Mycket försiktigt bort ~ 2 / 3 av media med en 200 l pipett att balansera pH-värdet i hydrogel. <ol class="lalpha"><li> ANVÄND INTE ett vakuum aspirator eftersom detta kommer att störa MATRIX </li><li> Placera pipettspetsen i brunnen så attDen berör inte den PuraMatrix sängen och försiktigt bort media från brunnen. </li><li> Försiktighet bör vidtas för att inte störa matrisen under den kultur av celler i PuraMatrix. </li></ol></li><li> Mycket försiktigt lägga 150 l färska medier cellodling på sidan av brunnen innehåller celler inkapslade i PuraMatrix. </li><li> Ändra media cellodling i varje brunn var 48 timmar med färska närsubstrat genom att försiktigt upprepa steg 10 och 11. </li></ol> Representativa resultat: <img src="/files/ftp_upload/1692/1692_fig1tmb.jpg" alt="Figur 1" border="0" /> Figur 1. OVCAR-5 celler inkapslade som beskrivs i ovanstående protokoll. Bilderna har förvärvats med ett inverterat Olympus FV1000 mikroskop utrustat med Spectra-Physics DeepSee Ti: Sapphire lasern inställd på 750 nm. Imaging sessioner genomfördes på dag 1, 3, 5 och 7 efter plätering. En lång arbetsavstånd, vatten doppning 40x mål (Olympus LUMPLFLN 0,8 NA) användes för att bilden genom PuraMatrix. Tredimensionella volymer samlades in genom att förvärva Bildstaplar i 1,47 ìm axiell steg. Två icke-descanned detektorer samlat autofluorescens utsläppen med violett (440-490 nm) och grön (510-550 nm) bandpassfilter. Den slutliga bilder och djup filmer stack behandlades med ImageJ genom att kombinera båda upptäckt kanaler. Vänligen <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/1692/1692_fig1.jpg">klicka här för</a> att se en större version av figur 1.

<ol>
	<li>Gelain, F., Bottai, D., Vescovi, A., Zhang, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Designer+self-assembling+Peptide+nanofiber+scaffolds+for+adult+mouse+neural+stem+cell+3-dimensional+cultures.">Designer self-assembling Peptide nanofiber scaffolds for adult mouse neural stem cell 3-dimensional cultures.</a> PLoS One. 1, e119-e119 (2006).</li></ol>

puramatrix encapsulation of cancer cells

Ökande bevis tyder på att cellerna odling cancer i tre dimensioner mer exakt rekapitulerar komplexiteten i tumörbiologi. Många av dessa modeller använder färdigberedda basalmembranet som härrör från djur som innehåller en varierande mängd tillväxtfaktorer och cytokiner som kan påverka tillväxten av dessa modeller cellkultur. Här beskriver vi i detalj beredning och användning av PuraMatrix, en kommersiellt tillgänglig självaggregerande peptid gel som saknar animaliska material och patogener till att samla och sprida äggstockscancer linje cancercell, OVCAR-5. Vi börjar med att beskriva hur man kan förbereda PuraMatrix före användning. Därefter visar vi hur man korrekt att blanda PuraMatrix och cellsuspension att kapsla in cellerna i hydrogel. Vid tillägg av media cellodling eller injektion i en fysiologisk miljö, peptiden del av PuraMatrix snabbt själv monterar i en 3D-hydrogel som uppvisar en nanometer struktur skala fibrösa med en genomsnittlig porstorlek 500-200 nm<sup&gt; 1</sup&gt;. Dessutom visar vi hur man propagerar kulturer som odlats i inkapslad PuraMatrix. När inkapslade i PuraMatrix, OVCAR-5 celler montera in tredimensionella acinar strukturer som mer liknar den morfologi micrometastatic knutor ses vid klinisk än cellslager in vitro-modeller. Använda konfokalmikroskopi vi illustrerar uppkomsten av representativa OVCAR-5 celler inkapslade i PuraMatrix dag 1, 3, 5 och 7 efter plätering. Användningen av PuraMatrix till celler kultur cancer bör förbättra vår förståelse av sjukdomen och ge oss möjlighet att bedöma behandlingssvar hos mer kliniskt prediktiv modell system.

Watch this Scientific Journal Video about PuraMatrix Encapsulation of Cancer Cells at JoVE.com

PuraMatrix Encapsulation of Cancer Cells

Denna video visar hur du kapsla in och kultur cancerceller i PuraMatrix, en kommersiellt tillgänglig självaggregerande peptid gel.

PuraMatrix Inkapsling av cancerceller

Increasing evidence suggests that culturing cancer cells in three dimensions more accurately recapitulates the complexity of tumor biology. Many of these ...

Research

JoVE Journal

Biology

Title Cell Encapsulation by Droplets

Titel Cell Inkapsling av Droppar

Isolation and Analysis of Hematopoietic Stem Cells from the Placenta

Isolering och analys av hematopoetiska stamceller från moderkakan

Hematopoietic stem cells (HSCs) have the ability to self-renew and generate all cell types of the blood lineages throughout the lifetime of an individual. ...

Cellular Encapsulation in 3D Hydrogels for Tissue Engineering 

Cellular Inkapsling i 3D Hydrogeler för tissue engineering

The 3D encapsulation of cells within hydrogels represents an increasingly important and popular technique for culturing cells and towards the development ...

Isolation of Stem Cells from Human Pancreatic Cancer Xenografts

Isolering av stamceller från mänskliga xenografter Pankreascancer

Cancer stem cells (CSCs) have been identified in a growing number of malignancies and are functionally defined by their ability to undergo self-renewal ...

Isolation and Culture of Adult Epithelial Stem Cells from Human Skin

Isolering och odling av vuxna Epithelial stamceller från mänskliga Skin

The homeostasis of all self-renewing tissues is dependent on adult stem cells. As undifferentiated stem cells undergo asymmetric divisions, they generate ...

Flow Cytometry Purification of Mouse Meiotic Cells

Flödescytometri Rening av Mouse meiotiska celler

The heterogeneous nature of cell types in the testis and the absence of meiotic cell culture models have been significant hurdles to the study of the ...

Ex Vivo Culture of Primary Human Fallopian Tube Epithelial Cells

Ex Vivo Culture of Primary Human Fallopian Tube Epithelial Cells

Ex vivo Kultur av primära humana äggledaren epitelceller

Epithelial ovarian cancer is a leading cause of female cancer mortality in the United States. In contrast to other women-specific cancers, like breast and ...

Visualization of the Interstitial Cells of Cajal (ICC) Network in Mice

Visualization of the Interstitial Cells of Cajal ICC Network in Mice

Visualisering av interstitiella celler i Cajal (ICC) Network i Möss

The interstitial cells of Cajal (ICC) are mesenchymal derived "pacemaker cells" of the gastrointestinal (GI) tract that generate spontaneous slow waves ...

Isolation of Immune Cells from Primary Tumors

Isolering av immunceller från primära tumörer

Tumors create a unique immunosuppressive microenvironment (tumor microenvironment, TME) whereby leukocytes are recruited into the tumor by various ...

Induction and Analysis of Epithelial to Mesenchymal Transition

Induktion och Analys av Epithelial till mesenkymala övergång

Epithelial  to mesenchymal transition (EMT) is essential for proper morphogenesis during  development. Misregulation of this  process has been implicated ...