Name: quantitative real-time pcr using the thermo scientific solaris qpcr assay
Uploaded: 2010-06-17T17:04:00
Duration: 9 min 21 s
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1. Die Thermo Scientific Solaris qPCR Assay-Design-Algorithmus <ol><li> Der Algorithmus in das Design der Solaris qPCR Sonde / Primerpaare verwendet passt die Tm jeder Komponente wodurch universelle Radfahren Bedingungen. Der Einbau der MGB, oder kleine Furche binden, Einheit in der Sonde erhöht die Tm und ermöglicht kürzere Sonden, um eine größere Assay Flexibilität und Leistung ausgelegt sein. Wie ihr Name schon sagt, sind MGBs eine Klasse von Antibiotika, die in die kleine Furche der DNA-Helix passt. MGBs sind die 3 oder 5 Ende einer DNA-Sonde befestigt. In Lösung wird die FAM-Reporter Fluoreszenz der Sonde von Eclipse Dunkle Quencher gequencht. Wenn die Sonde an eine Zielsequenz bindet, kann die daraus resultierende Veränderung in der Sonde s 3-D-Konformation ein starkes Fluoreszenzsignal. Die Bindung der DNA-Sonde zur Zielsequenz wird durch die MGB, die den Einsatz von hochspezifischen, kürzere Sonden ermöglicht und gleichzeitig die entsprechende Schmelztemperatur für PCR stabilisiert. So tritt Signalerkennung beim Glühen Phase der Target-Amplifikation. Während der Erweiterung Schritt distanziert die MGB-Sonde und die Fluoreszenz wieder abgeschreckt. Weil die Sonde distanziert, hat dies keine Auswirkungen PCR-Effizienz. </li><li> Ein weiteres Merkmal der Solaris-Algorithmus ist die Verwendung von Superbases. Superbases sind Grundlagen, die verbindliche Fähigkeiten verbessert haben, um die Stabilität von AT-Anleihen zu verbessern und zu beseitigen GG Selbstassoziation in Guanin reiche Sequenzen modifiziert. Hinzu kommt, dass sie nicht auslöschen benachbarten Fluorophoren an der 5-Terminus angehängt. Diese Basen sind selektiv platziert, nach dem Algorithmus, um die Verfügbarkeit von Zielsequenzen zu erweitern. Dies macht es möglich, Sequenzen, wie GC-reiche Regionen, die sonst in der Gestaltung Primer und Sonden vermieden werden verwenden würde. </li><li> Wann immer möglich, enthält die Solaris-Algorithmus Exon Junction Spanning Regionen in der Ziel-Site. Dies erhöht die Spezifität durch die Vermeidung der Verstärkung der Verunreinigung genomischer DNA. </li><li> Wichtig ist, dass der Algorithmus identifiziert auch eine Konsensus-Sequenz für alle bekannten Splice-Varianten, so dass alle von einer einzigen Sonde / Primer-Set abgedeckt sind. So ist nur ein Test für ein bestimmtes Gen von Interesse erforderlich. </li><li> Schließlich nutzt das Solaris qPCR Assay-Design-Algorithmus sehr strenge Parameter für kritische Überlegungen zum Entwurf einschließlich GC-Gehalt, Länge, Tm, und erstreckt sich von homogenen Nukleotiden. Die resultierenden Sequenzen BLAST für die Spezifität mit 3 verschiedenen Datenbanken analysiert: genomische, Transkript, und Pseudogen. </li></ol> 2. Beziehen Solaris Reagenzien <ol><li> Um die entsprechende Solaris Reagenzien, besuchen <a href="http://dharmacon.com">www.thermo.com / solaris</a> </li><li> Sobald Sie auf der Website auf &quot;GENEius Produktsuche&quot; klicken. Um direkt zu den GENEius Produkt zu suchen, gehen <a href="http://www.dharmacon.com/catalogsearch/consolidatedsearch.aspx">www.thermo.com / SolarisSearch</a> </li><li> Klicken Sie in der Suchanfrage ein und wählen Sie den entsprechenden Zielorganismen. </li><li> Die GENEius Produktsuche verarbeiten kann viele verschiedene Gen-IDs. Geben Sie hier eine der vorgeschlagenen Suchbegriffen, um das Gen von Interesse, einschließlich Ref Seq Beitritt, der Gene-ID, die Gene Symbol, ein Gene Beschreibung der Sanger-ID oder Zugangsnummer oder eine Katalog-Nummer zu finden. Dann auf &quot;Suchen&quot; klicken. </li><li> Identifizieren des Gens von Interesse und klicken Sie auf &quot;Auswählen&quot; auf der linken Seite. Es öffnet sich ein Fenster, das die verschiedenen Thermo Scientific Produkte für das Gen von Interesse zeigt. Unter &quot;Produkte&quot; die Option &quot;qPCR Detection&quot; Tab. </li><li> Unter dem &quot;Solaris Gene Expression Assay&quot; Überschrift, sehen Sie eine optimal Solaris Sonde / der Primer-Assay entwickelt. Dieser Test deckt alle bekannten Spleißvarianten des Gens Ziel. Wählen Sie die gewünschte Menge. Sie sind in 100, 200, 400 zur Verfügung, und 1000 X 25 ul Reaktionen (wenn der Test als made-to-order identifiziert wird, die 100 Packungsgröße nicht verfügbar). Klicken Sie auf &quot;In den Warenkorb&quot;. </li><li> Als nächstes wählen Sie den entsprechenden Master-Mix für den Thermocycler, die verwendet werden. Um festzustellen, welche Master-Mix funktioniert am besten mit der Maschine zur Verfügung, klicken Sie auf &quot;Finden Sie heraus, welche Master Mix am besten mit Ihrem PCR Cycler!&quot; </li><li> Finden Sie die qPCR-Cycler, dass auf der Speisekarte verwendet werden, um festzustellen, welcher Mix zu verwenden. </li><li> Zurück zur GENEius Produktsuche Fenster, und wählen Sie den entsprechenden Master-Mix. Der Master-Mix kommt in 100, 200, 400 und 1000 Reaktion Größen. Klicken Sie auf &quot;In den Warenkorb&quot;. </li><li> Zitiervorschlag Gene und verso cDNA-Synthese-Kits können auch für eine vollständige qRT-PCR-Analyse bestellt werden. </li><li> Wenn das Solaris-qPCR-Reagenzien kommen, bewahren Sie sie bei -20 ° C bis zur Verwendung. Die folgenden Reagenzien empfangen werden soll: Ein 20fach-Lösung mit zwei Primern bei 800 nm und je einem Gen spezifischen Sonde bei 200 nm, sequ vorgesehenENCE Informationen sowohl für die Sonde und die Primer-und Solaris-qPCR Gene Expression Master Mix in einer 2X-Konzentration. Solaris qPCR Gene Expression Assays sind für mindestens 12 Monate stabil. Vermeiden Sie wiederholtes Einfrieren und Auftauen. </li></ol> 3. qPCR-Setup <ol><li> Beginnen Sie mit der qPCR-Protokoll mit cDNA. Gesamt-RNA extrahiert sollte mit einem Spin-Säule Methode. Die Thermo Scientific Verso cDNA-Synthese-Kit ist für die reverse Transkription in cDNA zu erzeugen empfohlen. </li><li> Bereiten Sie sich für qPCR durch Auftauen der Primer, Sonden und Master-Mix auf Eis. Auch zur Hand haben PCR-Wasser und Deckweiß qPCR-Platten, die die Sensitivität der Real-time PCR zu verbessern. </li><li> Der Master-Mix enthält alle Komponenten für die Echtzeit-PCR einschließlich: 1) Thermo-Start-DNA-Polymerase, ein Hot-Start-Version von Thermoprime DNA-Polymerase. Diese Art der Polymerase wird verwendet, um unspezifische Amplifikation während der Reaktion-Einrichtung zu vermeiden und erfordert die Aktivierung bei 95 ° C 15 min. 2) dNTPs in der Solaris-Master-Mix, ersetzt dTTP dUTP zu Amplifikationseffizienz 3) Proprietary Reaktionspuffer, optimiert, um mit Solaris Primer / Sonden-Assays zu maximieren. Diese Reaktion Puffer enthält blauen Farbstoff, um den Kontrast zwischen Reagenz und Kunststoff zu erhöhen. 4) ROX, wenn Ihr qPCR Gerät benötigt ROX. </li><li> Nachdem die Lösungen aufgetaut haben, Dazu den Schlauch (nicht vortexen) mischen. Spin sie nieder, um den Verlust von Reagenz zu verhindern. </li><li> Als nächstes bereiten ein 15 mL sterile Falcon-Röhrchen zum Einrichten der Reaktion Mix für das Gen von Interesse, plus einer für den Gen, Scaling-up in Abhängigkeit von der Anzahl der Proben. Bereiten Sie genug, so dass drei Wiederholungen kann für jede Probe vorbereitet werden, einschließlich einer Nicht-Template (NTC) und Standard-Kurve Proben, wenn die Standard-Kurve zur Analyse verwendet werden. </li><li> Für jede Probe auf einer 96-Well-Platte laufen, mischen Sie die folgenden: 5 ul des 2X Solaris qPCR Master Mix, .5 ul des Solaris Primer / Probe-Set (20X) und PCR-Wasser, so dass die Endreaktionsvolumen einmal die cDNA angefügt werden mit 25 ul werden. Für jede Probe auf einer 384-Well-Platte laufen Mix folgende: 12,5 ul des 2X Solaris qPCR Master Mix, 1,25 ul des Solaris Primer / Probe-Set (20X) und PCR-Wasser, so dass die Endreaktionsvolumen, sobald die cDNA hinzugefügt werden 10 ul werden. </li><li> Mit einer Multi-Kanal-Pipette, übertragen Sie die Master-Mix in die entsprechenden Vertiefungen der Platte. Der blaue Farbstoff in der Master-Mix enthalten wird bei der Verfolgung Pipettieren Fortschritte auf dem weißen Teller Hilfe. Dann fügen Sie von 1-5 ul cDNA-Template (für eine 96-Well-Platte) oder 1-2 ul der cDNA-Template (für eine 384-Well-Platte). Pipette auf und ab zu mischen. Die Platte wird in eine Zentrifuge und Spin-Down, um Luftblasen zu entfernen, da diese mit der Fluoreszenz-Messungen stören. </li><li> Programmieren Sie den Thermocycler: Das Enzym muss aktiviert werden, eine 95 ° C 15 min (1 Zyklus). Dann wurden 40 Zyklen von 95 ° C, Denaturierung für 15 Sekunden und Annealing und Extension bei 60 ° C für 60 Sekunden. </li><li> Die Platte wird in der qPCR Instrument. Starten Sie das Programm. </li></ol> Vertreter qPCR Ergebnisse mit Solaris <img src="/files/ftp_upload/1700/1700fig1.jpg" alt="Abbildung 1" /> Abbildung 1. Solaris-Assays geben zuverlässige Erkennung selbst bei sehr niedrigen Konzentrationen Eingang, wie die PCR-Effizienz und r2-Werte beurteilt. Zehn 10-fache Verdünnungen der cDNA aus synthetischen RNA-Amplikon DNA-Sequenz oder Amplikon-Sequenz synthetisiert wurde auf einem ABI 7900HT Instrument mit Solaris qPCR Gene Expression Assays für F2RL1 oder Cdc20 bzw. verstärkt. Die log-Skala Amplifikationskurven und Standard-Kurven sind zusammen mit der Leistung der einzelnen Tests einschließlich Effizienz, r2 Wert, Dynamikbereich von 10 log10 Verdünnungen und die untere Nachweisgrenze dargestellt. <img src="/files/ftp_upload/1700/1700fig2.jpg" alt="Abbildung 2" /> Abbildung 2. Solaris Assays geben konsistente Ergebnisse auch zwischen verschiedenen Forscher und Laboratorien. siRNAs ALDOA und PPIB, sowie eine Non-Targeting-Control (NTC), wurden in HeLa-Zellen bei 100, 10, 1 und 0,1 nM Endkonzentration transfiziert. Die Zellen wurden geerntet und Gesamt-RNA isoliert 48 Stunden nach der Behandlung. cDNA wurde unter Verwendung von Thermo Scientific Verso cDNA Synthesis Kit. Ein Aliquot der cDNA wurde in zwei räumlich getrennten Labors verstärkt mit Solaris qPCR Gene Expression Assays für den Nachweis von ALDOA, PPIB und GAPDH auf einem Roche LightCycler 480 (384er)-Plattform. Knockdown wurde anhand der ΔΔCq Methode (normiert auf GAPDH Referenz-Gens und NTC-behandelten Zellen). Das gleiche Maß an Knockdown wurden für beide Gen-Targets zwischen beiden Forscher an beiden Standorten unter Beweis gestellt.

Die Autoren dieses Artikels sind die Mitarbeiter von Thermo Scientific.

Thermo Scientific Solaris qPCR-Assays bieten eine einfache, verbesserte Verfahren zur Durchführung von qPCR-Analyse. Mit einer hohen Stringenz Algorithmus unter Einbeziehung MGB-Technologie und Superbases maximieren diese Primer und Sonde setzt die Treue und die Robustheit der qPCR-Experimente. Ein Primer und Sonde gesetzt erkennt alle bekannten Spleißvarianten eines bestimmten Gens. Die Ziel-Website, wo immer möglich, umfasst Exon Spanning Regionen, um sicherzustellen, dass genomische DNA nicht verstärkt wird. Diese Eigenschaften machen es möglich, zahlreiche Proben gleichzeitig ausgeführt werden, sehr zur Verringerung der Menge an Zeit benötigt, um komplexe Experimente durchzuführen. Da die Master-Mix ist blau, ist es möglich, weiß-opake Platten, die die Empfindlichkeit der qPCR zu verbessern, ohne den Überblick zu verlieren Pipettieren verwenden. Zusammengenommen machen die Design-Merkmale der Solaris qPCR Assay diesem Roman qPCR Assay eine einfache, aber leistungsfähige Test, dass sowohl spezifische als auch robust ist.

quantitative real-time pcr using the thermo scientific solaris qpcr assay

Die Solaris qPCR Gene Expression Assay ist eine neue Art von Primer / Sonden gesetzt, entwickelt, um die qPCR-Prozess zu vereinfachen und gleichzeitig die Empfindlichkeit und Genauigkeit des Assays. Diese Primer / Sonden-Sets sind zu&gt; 98% der humanen und Maus-Genom und verfügen über signifikante Verbesserungen von bereits verfügbaren Technologien pre-designed. Diese Verbesserungen waren möglich durch ein neuartiges Design-Algorithmus von Thermo Scientific Bioinformatik-Experten entwickelt. Mehrere praktische Funktionen wurden in die Solaris qPCR Assay um den Prozess der Durchführung quantitativer real-time PCR rationalisieren eingeflossen. Zuerst wird das Protokoll ähnlich üblicherweise eingesetzten Alternativen, so dass die Methoden bei der qPCR verwendet werden wahrscheinlich vertraut sein. Zweitens ist die Master-Mix Blau, das macht die Einstellung der qPCR Reaktionen leichter zu verfolgen. Drittens sind die Temperaturwechsel die gleichen Bedingungen für alle Assays (Gene), die es ermöglichen, viele Proben gleichzeitig ausgeführt und reduzieren das Potenzial für Fehler. Schließlich werden die Sonde und Primer-Sequenz zur Verfügung gestellten Informationen und vereinfacht den Publikationsprozess. Hier zeigen wir, wie Sie die entsprechenden Solaris Reagenzien mit dem GENEius Produkt Suchfunktion auf der Website zum Bestellen (www.thermo.com / Solaris) und wie die Solaris-Reagenzien für die Durchführung von qPCR mittels Standardkurve Methode gefunden zu erhalten.

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Quantitative Real-Time PCR using the Thermo Scientific Solaris qPCR Assay

Die Solaris qPCR Gene Expression Assays sind neuartige pre-designed qPCR Primer / Sonden-Kombinationen entwickelt, um die qPCR-Prozess, ohne die Spezifität und Robustheit des Tests zu vereinfachen.

Quantitative Real-Time PCR unter Verwendung der Thermo Scientific Solaris qPCR Assay

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